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Aug 08, 2023

Entwicklung einer Plasmodium vivax-Biobank für funktionelle Ex-vivo-Assays

Malaria Journal, Band 22, Artikelnummer: 250 (2023) Diesen Artikel zitieren 1 Details zu Altmetric Metrics Plasmodium vivax ist die zweithäufigste Ursache für Malaria, bleibt jedoch aufgrund dieser Tatsache schwierig zu untersuchen

Malaria Journal Band 22, Artikelnummer: 250 (2023) Diesen Artikel zitieren

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Plasmodium vivax ist der zweithäufigste Erreger von Malaria, die Untersuchung stellt jedoch aufgrund des Fehlens eines kontinuierlichen In-vitro-Kultursystems weiterhin eine Herausforderung dar, was die Notwendigkeit verdeutlicht, eine Biobank klinischer Isolate mit mehreren Einfrierungen pro Probe zur Verwendung in Funktionstests einzurichten. Verschiedene Methoden zur Kryokonservierung von Parasitenisolaten wurden verglichen und anschließend die vielversprechendste validiert. Die Anreicherung von Parasiten im Früh- und Spätstadium sowie die Parasitenreifung wurden quantifiziert, um die Testplanung zu erleichtern.

Um Kryokonservierungsprotokolle zu vergleichen, wurden neun klinische P. vivax-Isolate mit vier Mischungen auf Glycerolytbasis eingefroren. Die Erholung der Parasiten nach dem Auftauen, nach der KCl-Percoll-Anreicherung und in einer kurzfristigen In-vitro-Kultur wurde mittels Objektträgermikroskopie gemessen. Die Anreicherung von Parasiten im Spätstadium durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) wurde gemessen. Auch die kurz- und langfristige Lagerung von Parasiten bei −80 °C oder flüssigem Stickstoff wurde verglichen.

Von den vier Kryokonservierungsmischungen führte eine Mischung (Glycerolyt:Serum:RBC im Verhältnis 2,5:1,5:1) zu einer verbesserten Erholung der Parasiten und einer statistisch signifikanten (P < 0,05) Steigerung des Parasitenüberlebens in einer kurzfristigen In-vitro-Kultur. Anschließend wurde mithilfe dieses Protokolls eine Parasiten-Biobank erstellt, die zu einer Sammlung von 106 klinischen Isolaten mit jeweils 8 Fläschchen führte. Die Qualität der Biobank wurde durch die Messung mehrerer Faktoren aus 47 Auftauvorgängen validiert: die durchschnittliche Verringerung der Parasitämie nach dem Auftauen (25,3 %); die durchschnittliche Anreicherung nach KCl-Percoll (6,65-fach); und die durchschnittliche prozentuale Erholung der Parasiten (22,0 %, gemessen an 30 Isolaten). Während der Kurzzeit-In-vitro-Kultur wurde bei 60,0 % der Isolate innerhalb von 48 Stunden eine starke Reifung der Parasiten im Ringstadium zu späteren Stadien (> 20 % Trophozoiten, Schizonten und Gametozyten) beobachtet. Die Anreicherung reifer Parasitenstadien über MACS zeigte eine gute Reproduzierbarkeit mit einer durchschnittlichen Post-MACS-Parasitämie von 30,0 % und einem Durchschnitt von 5,30 × 105 Parasiten/Fläschchen. Schließlich wurde der Einfluss der Lagertemperatur getestet und es wurden keine großen Auswirkungen einer kurzfristigen (7 Tage) oder langfristigen (7–10 Jahre) Lagerung bei –80 °C auf die Erholung, Anreicherung oder Lebensfähigkeit der Parasiten beobachtet.

Hier wird eine optimierte Einfriermethode für klinische P. vivax-Isolate als Vorlage für die Erstellung und Validierung einer Parasiten-Biobank zur Verwendung in Funktionstests demonstriert.

Plasmodium vivax ist die geografisch am weitesten verbreitete Malariaparasitenart und für die zweithöchste Malariabelastung weltweit verantwortlich. Während die Gesamtinzidenz von P. vivax weltweit von 20,5 Millionen Fällen im Jahr 2000 auf 4,9 Millionen Fälle im Jahr 2021 zurückgegangen ist [1], bestehen nach wie vor erhebliche Hindernisse bei den Bemühungen, diesen Erreger auszurotten, darunter das Fehlen eines P. vivax-Impfstoffs und die zunehmende Resistenz dagegen Medikamente gegen Malaria.

Die Erforschung der grundlegenden Biologie von P. vivax war aufgrund des Fehlens eines kontinuierlichen In-vitro-Kultursystems stark eingeschränkt [2,3,4]. Dieser Mangel an kontinuierlicher Kultur erfordert die Verwendung klinischer P. vivax-Isolate für experimentelle Untersuchungen, und der begrenzte Zugang zu diesen Isolaten hat den Fortschritt bei der Weiterentwicklung des Wissens über diesen Parasiten behindert. Kürzlich wurden kurzfristige In-vitro-Kulturansätze für P. vivax etabliert (einschließlich in einigen Fällen der Verwendung von kryokonservierten Isolaten) [3, 5, 6], die es ermöglichen, Arzneimittelresistenztests in einem Zyklus durchzuführen [3, 7]. sowie Invasionstests zur Beurteilung des Retikulozytentropismus des Wirts [8], der Auswirkungen von Invasionshemmantikörpern [9,10,11,12,13,14,15,16] und Wirtsrezeptormutanten [17, 18]. Die Bedeutung der Biobanking von Proben von Infektionskrankheiten [19,20,21], einschließlich Plasmodium falciparum [22,23,24], wird zunehmend anerkannt. Die Erstellung einer Biobank kryokonservierter P. vivax-Isolate, die für nachgelagerte Experimente (Funktionstests, Genexpressionstests, Genomik) zuverlässig aufgetaut werden kann, wäre eine entscheidende Ressource für weitere Fortschritte auf diesem Gebiet [4].

Die Kryokonservierung von Malariaparasiten im Blutstadium hat eine lange Geschichte, wobei frühe Studien auf dem schnellen Einfrieren auf Trockeneis- oder Flüssigstickstofftemperaturen und dem schnellen Auftauen von Erythrozyten beruhten [25, 26] (Übersicht in [27]). Diese frühen Experimente wurden ohne Kälteschutzmittel durchgeführt und führten zu einer geringen Erholung der Parasiten und einem hohen Grad an Erythrozyten-Lyse. Die meisten modernen Methoden verwenden Kryoschutzlösungen auf Glycerinbasis, die die Rückgewinnung von Erythrozyten verbesserten [28,29,30,31], während eine Minderheit Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendet hat [30, 31] (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Es wurden mehrere Kryokonservierungsmethoden für P. vivax beschrieben [5, 7, 32, 33, 34, 35, 36], wobei die meisten auf der Zugabe verschiedener Verhältnisse gepufferter 57 %iger Glycerin/Lactat-Lösung (Glycerolyte 57) zu gepackten Erythrozyten basieren. Bisher gab es jedoch keinen systematischen Vergleich der Wirksamkeit dieser verschiedenen Kryokonservierungsmethoden für P. vivax, was größtenteils auf das begrenzte Forschungsmaterial zu klinischen Isolaten zurückzuführen ist.

Hier wurde eine kontinuierliche Quelle von Patienten-P. vivax-Isolaten vom Goa Medical College and Hospital in Goa, Indien, genutzt, um die Wirksamkeit von vier verschiedenen Kryokonservierungsansätzen zu vergleichen. Anschließend wurde eine experimentelle Biobank kryokonservierter P. vivax-Isolate eingerichtet, und diese Proben wurden verwendet, um die Effizienz der Parasitenwiederherstellung nach dem Auftauen, die Anreicherung von Parasiten im Frühstadium durch KCl-Percoll-Dichtesedimentation [3, 37] und die Reifung von Parasiten zu validieren in kurzfristiger In-vitro-Kultur und der Anreicherung von Parasiten im reifen Stadium nach MACS [38]. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von Temperaturwechseln zwischen – 80 °C (Trockeneis/Gefrierschrank) und – 196 °C (flüssiger Stickstoff) getestet, um die Temperaturänderungen, die während des Transports gefrorener Proben auftreten, kurz- und langfristig zu modellieren Lagerung. Diese Ergebnisse werden in die zukünftige Kryokonservierung und den Transport von P. vivax-Proben einfließen und bei der Einrichtung kryokonservierter Biobanken für zukünftige experimentelle Versuche mit diesem wenig erforschten Parasiten helfen.

Das Probandenprotokoll und die Einverständniserklärungen für die Aufnahme von mit Plasmodium infizierten Patienten in diese Studie am Goa Medical College and Hospital (GMC) wurden von den Institutional Review Boards der Abteilung für Mikrobiologie und Infektionskrankheiten (DMID) am US National Institute überprüft und genehmigt of Allergy and Infectious Diseases (Zulassung DMID 11-0074), der University of Washington (Zulassung 42271/1192) sowie dem Institutional Ethics Committee (IEC) am Goa Medical College Hospital, Bambolim, Goa, Indien.

Die Studie wurde am Goa Medical College Hospital im Labor des Malaria Evolution in South Asia-International Centers for Excellence in Malaria Research durchgeführt. Venöses Blut wurde in 6-ml-Vacutainer-Röhrchen (Säure-Dextrose-Lösungs-Antikoagulans; BD India, Nr. 364606) von allen im Abstrich positiv auf eine P. vivax mono-Infektion untersuchten Patienten mit unterzeichneter Einverständniserklärung im Alter zwischen 12 Monaten und 65 Jahren von 2013 bis 2019 gesammelt . Schwangere (selbst gemeldete) und anämische Patienten wurden von der Einschreibung ausgeschlossen.

Klinische Proben, die im Schnelldiagnosetest (FalciVax, Zephyr Biomedicals #50300025, Goa, Indien) positiv auf P. vivax getestet wurden, wurden gesammelt und Abstriche wurden vorbereitet und mit den Field Stains A (Himedia India, #S008) und B (Himedia India, #S009). Proben mit einer Parasitämie > 0,01 % wurden zur weiteren Analyse einbezogen. Das Blut wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 800 g zentrifugiert, und das Serum von jedem Isolat wurde abgetrennt und für entsprechende Studien bei –80 °C gelagert. Das pelletierte Blut wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Thermo Fisher Scientific, USA, Nr. J61196.AP), ergänzt mit 0,5 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (Millipore Sigma USA, Nr. 10735086001), gewaschen, um alle verbleibenden Serumbestandteile abzutrennen. Vor der Kryokonservierung wurde das pelletierte Blut von Leukozyten getrennt, indem die Probe durch im Labor vorbereitete CF-11-Säulenfilter geleitet wurde. Nach der Verarbeitung mit CF-11 wurden Abstriche angefertigt, um die Parasitenstadien zu beurteilen und die Leukozytenentfernung zu untersuchen. Von Leukozyten befreite Proben wurden unter Verwendung von Glycerolyte 57 (Baxter/Fenwal USA, #4A7833) kryokonserviert und wie folgt hinzugefügt: Das Verhältnis von Glycerolyte 57:Serum:RBC betrug 2:0:1 für Mischung 1 [7], 2,5:1,5:1 für Mischung 2 [35, 39], 1,66:0:1 für Mischung 3 [36] und 4,15:1,5:1 für Mischung 4. Die Proben wurden zuvor 24 Stunden lang in Kryoröhrchen (Fisher Scientific USA, Nr. 50001020) bei –80 °C gelagert zur Langzeitlagerung in Kryotanks mit flüssigem Stickstoff bei −196 °C. Das in der Studie verwendete Serum war hitzeinaktiviertes AB +-Poolplasma (Access Biologicals, USA, Nr. A17054), das aus einer Region ohne Malaria-Endemie gesammelt wurde.

Plasmodium vivax-Isolate wurden nach einem Standardprotokoll aufgetaut [39]. Die Proben wurden schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von 1/10 Volumen 12 % (Gew./Vol.) NaCl (Himedia India, #TC046) und 10 Volumina 1,6 % (Gew./Vol.) NaCl. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten lang bei 500 g pelletiert und dann 2 × mit IMDM + Glutamax-Medium (Thermo Fisher Scientific, USA, Nr. 31980030) gewaschen. Parasiten wurden unter Verwendung von 1,080 g/ml KCL-Percoll-Gradienten angereichert [3, 37] (Percoll: Cytiva/Millipore Sigma #17-5445-01; KCl: Himedia India, #TC010). Drei Milliliter der Probe im Medium (mit einem Hämatokritwert zwischen 20 und 25 %) wurden bei Raumtemperatur in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf ein gleiches Volumen von 1,080 g/ml KCl-Percoll geschichtet. Die geschichtete Probe wurde 15 Minuten lang bei 1200 g mit langsamer Beschleunigung und ohne Bremse zentrifugiert. Die angereicherten Parasiten aus der Percoll-Schnittstelle wurden in IMDM + Glutamax + 0,5 % (v/v) BSA gewaschen und anschließend in IMDM + 10 % (v/v) AB + hitzeinaktiviertem Serum mit 0,5 % (v/v) kultiviert. Gentamycin (Thermo Fisher Scientific, USA #15750060) pro Bedingung in 1-ml-Volumina in 24-Well-Platten (Nunc/Thermo Fisher Scientific, USA, #144530). Der Hämatokrit lag zwischen 0,2 und 3,5 %, der Durchschnitt lag bei 1,8 %. Die Platten wurden je nach Bedarf 24–72 Stunden lang bei 37 °C und mit Mischgas (5 % CO2, 10 % O2 und 85 % N2-Kombination) in modularen Inkubatorkammern (Billups Rothenberg, USA, #MIC-101) inkubiert Datenauswertung. Die Anreicherung von Parasiten über MACS wurde wie zuvor berichtet durchgeführt (40).

Die Objektträger für die Experimente wurden auf einem Lichtmikroskop unter Verwendung eines 100-fachen Objektivs mit Ölimmersion und einem 1:4-Retikel auf einem Zeiss Primo Star-Mikroskop gezählt. Die Objektträger wurden stufenweise mit der Ganzfeldmethode [41] über mehrere Felder (15–20 Felder) gezählt und abgerufen, bis 500 rote Blutkörperchen in dem kleinen Feld des 1:4-Retikels gezählt wurden. Die Objektträger für die verschiedenen Zeitpunkte während des Experiments wurden mit einem Cytospin (Shandon/Thermo Scientific) mit 100 µL 10 % (w/v) Rinderserumalbumin in PBS vorbereitet. Parasitämie wurde berechnet als:

wobei der Gesamtfeldfaktor für das 1:4-Absehen 10,9 betrug.

Alle Daten für die Experimente wurden mit Microsoft Excel und Graphpad Prism (Version 9.8.14) analysiert. Vergleiche zwischen den Versuchsbedingungen wurden über eine Einweg-ANOVA-Analyse durchgeführt (oder wenn Objektträgerdaten aufgrund nicht lesbarer Objektträger fehlten, über eine Mixed-Effect-Modellanalyse). Die Analyse wurde mit Matching durch Parasitenisolat unter der Annahme einer Gaußschen Verteilung der Residuen und der Annahme einer Sphärizität durchgeführt. Der Mehrfachvergleichstest von Tukey wurde verwendet, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen einzelnen Krankheitssätzen zu ermitteln. Primärdaten für alle Ergebnisse finden Sie in der Zusatzdatei 2.

Unter den Malaria-positiven Personen, die sich am Goa Medical College and Hospital (GMC) vorstellen, sind > 80 % mit P. vivax infiziert [42]. Die Fähigkeit, diese Anzahl von P. vivax-Isolaten zu sammeln, hat GMC zu einem einzigartigen Umfeld für die Entwicklung einer Biobank kryokonservierter Parasiten für zukünftige Experimente gemacht. Von 2012 bis 2016 wurden über 700 P. vivax-Isolate mit der Methode von Kosaisavee et al. kryokonserviert. [7], wobei ein Verhältnis von 2:1 des Kryoschutzmittels Glycerolyt:RBCs verwendet wurde. Andere Verhältnisse von Glycerolyt:RBCs wurden in der Literatur für die Kryokonservierung von P. falciparum und P. vivax berichtet (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Vier Kryokonservierungsmischungen, abgeleitet von etablierten Kryokonservierungsprotokollen [7, 34, 36, 39] (Abb. 1A), die sich im Verhältnis von Glycerolyt zu Erythrozyten (mit oder ohne Zusatz von Serum) unterschieden, wurden getestet, um etwaige Unterschiede festzustellen aus dem etablierten 2:1 Glycerolyt:RBC-Verhältnis.

Vergleich von vier verschiedenen Gefriermischungen. A Neun klinische P. vivax-Isolate wurden unter Verwendung von vier Mischungen mit unterschiedlichen Verhältnissen von Erythrozyten, Serum und Glycerolyt kryokonserviert. Vergleich von B-Parasitämie nach dem Auftauen, C-Post-KCl-Percoll-Parasitämie und D 24-Stunden-Parasitämie, alle normalisiert auf die Werte von Mischung 1. *P < 0,05 mittels einfaktorieller ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest

Neun P. vivax-Isolate wurden in vier gleiche Portionen aufgeteilt und jeweils mit einer der Mischungen kryokonserviert. Nach mindestens einer Woche Lagerung in flüssigem Stickstoff wurden diese Proben mit Standardmethoden aufgetaut [39] und die Parasitämie nach dem Auftauen, nach der Anreicherung über KCl-Percoll-Dichtegradienten [3, 37] und kurz nach 24 Stunden mittels Objektträgermikroskopie bestimmt -Befristete Ex-vivo-Kultur. Die Parasitämiewerte wurden bei jedem Schritt auf die Werte der Mischung 1 normalisiert. Nach dem Auftauen (Abb. 1B) wurde für Mischung 2 ein Anstieg der relativen Parasitämie beobachtet, der jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Nach der KCl-Percoll-Anreicherung (Abb. 1C) zeigten die Mischungen 2, 3 und 4 eine höhere relative Parasitämie als Mischung 1, erreichten jedoch wiederum keine statistische Signifikanz. Nach 24 Stunden in der Kurzzeitkultur (Abb. 1D) wurde für Mischung 2 im Vergleich zu Mischung 1 ein statistisch signifikanter Anstieg der relativen Parasitämie beobachtet (P = 0,0123, F (1,781, 12,47) = 6,690 mittels einfaktorieller ANOVA mit übereinstimmender Daten und Dunnetts Mehrfachvergleichstest). Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass die Kryokonservierung von P. vivax-Isolaten mit Mischung 2 zu einer verbesserten Erholung und Reifung von Parasiten führte und diese Kryokonservierungsformulierung für die Einrichtung einer verbesserten Biobank ausgewählt wurde.

Über einhundert P. vivax-Isolate wurden mit Mischung 2 kryokonserviert, wobei durchschnittlich 8 Fläschchen pro Probe erzeugt wurden (~ 300 µL gepackte Erythrozyten/Fläschchen). Die anfänglichen Parasitämien lagen zwischen 0,036 und 1,526 %, mit einem Median von 0,323 % und einem Durchschnitt von 0,384 % (Abb. 2A). Innerhalb der gesammelten Proben waren die mittleren Parasitämiewerte für Ringstadien (frühe Ringe (0,212 %); späte Ringe (0,071 %)) im Vergleich zu anderen Stadien am höchsten: frühe Trophozoiten (0,044 %); späte Trophozoiten (0,008 %); Schizonten (0,005 %) und Gametozyten (0,040 %) (Abb. 2B).

Charakterisierung der Biobank und Anreicherung von Ringen mittels KCl-Percoll. Eine Reihe von Parasitämiewerten vor dem Einfrieren für 106 kryokonservierte Isolate. B Verteilung der verschiedenen Phasen vor dem Einfrieren. C Vergleich der Parasitämiewerte vor dem Einfrieren, nach dem Auftauen und nach KCl-Percoll für 47 Isolate. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichen. Die unteren Kreisdiagramme zeigen den Anteil der Proben mit Parasitämien ≥ 0,2 %. D Verteilung der Faltenanreicherungen nach KCl-Percoll. E Verteilung der prozentualen Erholung von Parasiten während der KCl-Percoll-Anreicherung

Sowohl Arzneimittelresistenz- als auch Invasionstests mit P. vivax-Isolaten erfordern eine ausreichende Anzahl von Parasiten für zuverlässige Messungen. Daher wurden unterschiedliche Strategien zur Anreicherung von Parasiten im Ringstadium eingesetzt (z. B. für Arzneimittelresistenztests über KCl-Percoll-Gradienten). [3, 7]) oder im Schizontenstadium (z. B. für Invasionstests unter Verwendung von Percoll-Gradienten [10] oder magnetischer Anreicherung [17, 18, 40]). In einem zuvor veröffentlichten Arzneimittelresistenztest mit P. vivax [3] war für qualitativ hochwertige Messungen eine Parasitämie von mindestens 0,2 % erforderlich, und 72 % aller Isolate erreichten diesen Schwellenwert vor dem Einfrieren. Um etwaige Veränderungen der Parasitämie nach dem Auftauen zu charakterisieren und die Wirkung der KCl-Percoll-Anreicherung zu messen, wurde die Parasitämie vor dem Einfrieren, nach dem Auftauen und nach der KCl-Percoll-Anreicherung von 47 Isolaten gemessen (Abb. 2C). Zwischen allen drei Erkrankungen wurde ein statistisch signifikanter Unterschied in der prozentualen Parasitämie beobachtet (P = 0,0011 (F (1,034, 47,57) = 11,85) mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichen). Es gab eine durchschnittliche Erholung der Parasitämie um 74,7 % (Bereich 7,21–419,36 %) zwischen vor dem Einfrieren und nach dem Auftauen und eine durchschnittliche 6,7-fache (Bereich 0,13–39,0-fache) Anreicherung der Parasitämie nach KCl-Percoll (Abb. 2D). . Darüber hinaus sank der Anteil der Parasitenisolate, die den Schwellenwert von 0,2 % erreichten, von 68 % vor dem Einfrieren auf 43 % nach dem Auftauen, stieg jedoch anschließend nach KCl-Percoll auf 79 % (Abb. 2C, untere Kreisdiagramme), was den Nutzen dieser Maßnahme verdeutlicht Methode zur Erhöhung der Parasitämie. Die prozentuale Erholung der Parasiten während der KCl-Percoll-Anreicherung wurde auch geschätzt, indem sowohl der Prozentsatz der Parasitämie mittels Objektträgermikroskopie als auch die Gesamtzahl der Erythrozyten mittels Hämozytometerzählungen sowohl nach dem Auftauen als auch nach dem KCl-Percoll gemessen wurden (Abb. 2E). Die durchschnittliche Erholung betrug 22 % (Bereich 0,43 – 116,8 %), was darauf hindeutet, dass nicht alle Parasiten durch diesen Ansatz angereichert werden.

Während es für P. vivax kein Langzeitkultursystem gibt, wurde über eine kurzfristige Ex-vivo-Reifung von Parasiten berichtet [3, 6, 7, 10, 40]. Um die Reifungsfähigkeit biobankierter Isolate zu ermitteln, wurden insgesamt zwanzig Isolate für Validierungsexperimente ausgewählt. Die Proben wurden aufgetaut und auf KCl-Percoll-Gradienten angereichert und das Staging und die Parasitämie wurden nach der Anreicherung sowie nach 24 und 48 Stunden in einer Kurzzeitkultur gemessen (Abb. 3A). Im Verlauf dieser Experimente waren gelegentlich Objektträger unlesbar/beschädigt, und diese Isolate wurden zum gegebenen Zeitpunkt von der Analyse ausgeschlossen. Während der ersten 24 Stunden blieb die durchschnittliche Parasitämie relativ konstant, wobei bei einigen Isolaten ein Rückgang zu verzeichnen war; Nach 48 Stunden war jedoch in allen Proben ein durchschnittlicher Rückgang des Prozentsatzes der Parasitämie um 64,9 % zu verzeichnen. Die Reifung der Parasiten wurde quantifiziert, indem die Anzahl der Isolate mit unterschiedlichen Anteilen (< 20 %, 20–50 %, > 50 %) entweder unreifer Parasiten (frühe und späte Ringe) oder reifender Parasiten (Trophozoiten, Schizonten und Gametozyten) bestimmt wurde. (Abb. 3B). Nach der Anreicherung wiesen alle Isolate mindestens 20 % unreife Parasiten auf. Nach 24 Stunden hatten 57,9 % (11/19) > 20 % reife Stadien und eine Untergruppe von 26,3 % (5/19) hatte > 50 % reife Stadien. Diese Anteile änderten sich nicht nennenswert, da nach 48 Stunden 60 % der Isolate (12/20) > 20 % reife Stadien aufwiesen und 30 % (6/20) > 50 % reife Stadien aufwiesen.

Reifung von Parasiten in kurzfristiger Ex-vivo-Kultur. A Stadieneinteilung und Parasitämie aus 20 Biobankproben nach der Anreicherung, 24 Stunden und 48 Stunden in Kurzzeitkultur. B Kreisdiagramme, die den Anteil der Parasiten entweder im Ringstadium (frühe und späte Ringe) oder im Spätstadium (Trophozoiten, Schizonten, Gametozyten) über die Isolate hinweg zeigen

Reife Parasiten können durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) durch die paramagnetischen Eigenschaften von Hämozoin in der Nahrungsvakuole des Parasiten leicht angereichert werden [38] und sind eine gängige Methode zur Reinigung von Parasiten zur Verwendung in Invasionstests [17, 18, 40]. Nach mindestens 40 Stunden Kurzzeitkultur wurden die Parasiten über MACS angereichert (Abb. 4A), mit einer durchschnittlichen Parasitämie von 29,95 % (Bereich 0,52–80,81 %). Darüber hinaus wurde die Anzahl der Parasiten pro Fläschchen bestimmt (Abb. 4B), mit einem Durchschnitt von 5,30 × 105/Fläschchen (Bereich 7,68 × 104–2,90 × 106/Fläschchen). Diese Werte wären nützlich, wenn Parasiten für Invasionstests verwendet werden, um die Anzahl der Testvertiefungen zu bestimmen, die pro Isolat sinnvoll eingerichtet werden können.

Anreicherung kurzfristig kultivierter Parasiten über MACS. Parasitenproben wurden vor der MACS mindestens 40 Stunden lang kurzzeitig kultiviert. Eine Verteilung von Parasitämien nach MACS-Anreicherung. B Berechnete Anzahl Parasiten/Fläschchen nach MACS. C Berechnete prozentuale Erholung der Parasiten nach der MACS-Anreicherung. Verteilung der D-Parasitämie und der E-Anzahl der Parasiten/Fläschchen durch wiederholtes Auftauen von Biobank-Isolaten

Die Erholung von Parasiten durch MACS-Anreicherung wurde auch durch Messung der Anzahl der Erythrozyten mittels Hämozytometer und des Prozentsatzes der Parasitämie mittels Objektträgermikroskopie vor und nach MACS geschätzt. Bei den 11 getesteten Proben wurde eine durchschnittliche Wiederfindung von 20,59 % beobachtet (Bereich 5,94–51,44 %) (Abb. 4C). Die Reproduzierbarkeit der MACS-Anreicherung und der Parasitenrückgewinnung wurde auch bestimmt, wenn mehrere unabhängige Auftauvorgänge desselben Isolats durchgeführt wurden (Abb. 4D, E), und in den meisten Fällen schwankten der Prozentsatz der Parasitämie und die Anzahl der Parasiten pro Fläschchen um weniger als das Zweifache.

Zusätzlich zur Methode der Kryokonservierung kann die Lagerungs- und Transporttemperatur gefrorener Isolate ihre Lebensfähigkeit nach dem Auftauen beeinträchtigen. Frühere Studien mit P. falciparum haben gezeigt, dass die Lebensfähigkeit kryokonservierter Parasiten, die bei –70 °C gelagert werden, im Vergleich zu Temperaturen mit flüssigem Stickstoff verringert ist [27, 30]. Daher wurde ein Temperaturvariationsexperiment durchgeführt, um den Transport von Proben vom Sammelort zu anderen Orten für experimentelle Zwecke nachzuahmen. Neun Proben wurden mit Mischung 2 kryokonserviert, wodurch vier Fläschchen entstanden, die jeweils vier unterschiedlichen Temperaturlagerungsbedingungen ausgesetzt wurden (Abb. 5A). Fläschchen 1 (V1) war die Kontrollbedingung und wurde innerhalb von 5–8 Tagen direkt aus flüssigem Stickstoff aufgetaut. Die Fläschchen V2–V4 (Testbedingungen) wurden 7 Tage lang von flüssigem Stickstoff auf –80 °C überführt, um die Versandbedingungen auf Trockeneis nachzuahmen. Fläschchen V2 wurde nach 7-tägiger Lagerung bei –80 °C aufgetaut, während die Fläschchen V3 und V4 für weitere 7 Tage in flüssigen Stickstoff zurückgestellt wurden, um mögliche Temperaturschwankungen an einem Ort nachzuahmen, an dem die Proben zur Lagerung in flüssigen Stickstoff zurückgeführt wurden. Fläschchen V4 wurde vor dem Auftauen ein zweites Mal auf –80 °C erhitzt, während Fläschchen V3 nach 7 Tagen aus flüssigem Stickstoff aufgetaut wurde.

Vergleich von Gefrier- und Lagerbedingungen. (A) Schematische Darstellung der getesteten Parasiten-Gefrier- und Lagerbedingungen (V1–V4). Vergleich der Proben nach dem Auftauen (B), nach KCl-Percoll (C), 24 Stunden (D) und 48 Stunden (E) mit auf V1 normalisierten Parasitämiewerten. **P < 0,01 mittels Mixed-Effects-Analyse mit Dunnetts Mehrfachvergleichen. Vergleich von Proben, die langfristig (7–10 Jahre) entweder in flüssigem Stickstoff oder bei –80 °C gelagert wurden: (F) nach dem Auftauen und (G) nach 24 Stunden in Kurzzeitkultur

Nach dem Auftauen wurden alle Proben über KCl-Percoll angereichert und kurzzeitig mit mikroskopischer Untersuchung beim Auftauen, der Anreicherung und nach 24-stündigem und 48-stündigem In-vitro-Wachstum kultiviert, wobei die Daten auf die V1-Werte normalisiert wurden (Abb. 5B – E). Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Bedingungen nach dem Auftauen oder nach Percoll beobachtet. Allerdings wurde für Zustand V2 nach 24 Stunden eine signifikante Verringerung der Parasitämie beobachtet (P = 0,010 (F (1,399, 9,330) = 9,024) mittels Mehrfacheffektanalyse mit Dunnetts Mehrfachvergleichen), obwohl diese Verringerung nach 48 Stunden nicht beobachtet wurde. Um außerdem zu testen, ob die Lagerung von Parasiten bei unterschiedlichen Temperaturen möglicherweise langfristige Auswirkungen hat, wurde eine Reihe von Isolaten verglichen, in denen Fläschchen zwischen 7 und 10 Jahren sowohl bei flüssigem Stickstoff als auch bei Temperaturen von –80 °C gelagert wurden ( Abb. 5F, G) (beachten Sie, dass diese Proben mit Mischung 1 kryokonserviert wurden). Es wurden weder nach dem Auftauen noch nach 24 Stunden in der Kurzzeitkultur statistisch signifikante Unterschiede in der Parasitämie beobachtet, was darauf hindeutet, dass beide Lagertemperaturen den Parasiten konservieren können.

Die Einrichtung einer Biobank kryokonservierter P. vivax-Isolate, die für die Weiterverarbeitung zuverlässig aufgetaut werden können, wäre ein wirksames Instrument zur Erleichterung der Forschung mit diesem Parasiten. Das derzeitige Fehlen eines Kultursystems für P. vivax schließt die Art von Experimenten aus, die mit anderen kultivierbaren Plasmodium-Arten wie P. falciparum [43] und Plasmodium knowlesi [44,45,46] durchgeführt werden können. Es wurden Fortschritte bei der Zählung und Einstufung von P. vivax erzielt, die die Sammlung von P. vivax für eine solche Ressource erleichtern würden [3, 41]. Sammlung ordnungsgemäß konservierter und gelagerter Isolate, kombiniert mit der Möglichkeit, Proben mit geringer Parasitämie mithilfe von KCl-Percoll-Gradienten für Tests im Ringstadium (z. B. Arzneimittelresistenztests) anzureichern oder reife Parasiten über Percoll-Gradienten oder MACS anzureichern (z. B. für Invasionstests) würde funktionelle Tests mit diesem wenig erforschten Parasiten erleichtern. Es wären nicht nur mehr Tests möglich, sondern die Erstellung einer Biobank mit mehreren Einfrierungen desselben Spenders würde auch die Durchführung von Wiederholungsexperimenten ermöglichen, was im Allgemeinen nicht möglich ist, wenn nur lebende Isolate gesammelt werden können. Schließlich verlängert die Einrichtung einer zuverlässigen Quelle kryokonservierter Isolate die Dauer des Experiments über die typische Hochsaison mit hoher Übertragung hinaus, in der die meisten klinischen Isolate gesammelt werden.

Um die Erstellung einer kryokonservierten Biobank zu unterstützen, wurde das Fortschreiten und die Reifung asexueller Blutstadien von P. vivax nach dem Auftauen von Fläschchen untersucht, die mit vier verschiedenen Kryokonservierungsmischungen mit unterschiedlichen Verhältnissen von Glycerolyte 57 zu Erythrozyten (mit oder ohne Einschluss) kryokonserviert worden waren von Serum). Obwohl die Endkonzentration an Glycerin schwankte (4,12 M (Mischung 1), 3,10 M (Mischung 2), 3,86 M (Mischungen 3 und 4)) (Zusatzdatei 1: Tabelle S1), zeigten die vier Mischungen weitgehend ähnliche Eigenschaften in Bezug auf Parasitämien nach dem Auftauen, nach der KCl-Percoll-Anreicherung und in kurzfristigen Ex-vivo-Kulturen. Allerdings wurde Mischung 2 gewählt, um eine optimierte Biobank zu erstellen, da die Parasiten im Vergleich zu den anderen Mischungen eine höhere Erholung und Lebensfähigkeit aufweisen.

In Übereinstimmung mit früheren Experimenten zur kurzfristigen Kulturoptimierung [3] wurde eine weniger als 100-prozentige Erholung der Parasiten nach dem Auftauen (Abb. 1C) sowie das Vorhandensein von piknotischen und lysierten Parasiten während der In-vitro-Kultur beobachtet (Abb. 3). Dies deutet darauf hin, dass weitere Verbesserungen der Kryokonservierungs- und Auftaumethode möglich sein könnten, wie etwa ein Vergleich der Sorbit-Methode [39], um zu sehen, ob es im Vergleich zur derzeit verwendeten Natriumchlorid-Methode zu einer besseren Erholung von Parasiten kommt [39]. Darüber hinaus kann die Messung der Lyse roter Blutkörperchen auch hilfreich für das Verständnis der Wirksamkeit verschiedener Kryokonservierungsbedingungen sein.

Über die Verwendung von Dichtegradienten zur Anreicherung von Retikulozyten wurde bereits früher berichtet, wobei der Schwerpunkt entweder auf Ansätzen von Nycodenz [37], wässrigen Mehrphasensystemen [47] oder Percoll [3, 40, 48] lag. Hier wurde die Fähigkeit von KCl-Percoll-Dichtegradienten gezeigt, Parasiten nach dem Auftauen auf ausreichend hohe Parasitämien für Arzneimittelresistenztests anzureichern (> 0,2 % Parasitämie [3]) (Abb. 1C). Die gemessene Erholung von Parasiten mit dieser Methode ist immer noch relativ gering (Abb. 1E), was darauf hindeutet, dass weitere Verbesserungen dieses Ansatzes möglich sein könnten. Zukünftige Experimente sollten auch direkt die Erholung von Retikulozyten (sowohl nicht infizierte als auch infizierte) sowie die Wirksamkeit der Erholung und Reifung sexueller Stadien messen [49], was für zukünftige Übertragungsstudien nützlich sein könnte.

Die Messung der Lebensfähigkeit und Reifung von Parasiten während einer kurzfristigen In-vitro-Kultur (Abb. 3) legt nahe, dass mindestens 60 % der Isolate in der Biobank zur vollständigen Reifung fähig sind (mit mindestens 20 % reifen Stadien). Dies ist möglicherweise eine Unterschätzung, da die Schizonten in einigen Isolaten zum Zeitpunkt der Erstellung der Objektträger nach 48 Stunden möglicherweise bereits ausgereift waren und ausgeschieden waren. Eine genauere Beurteilung der Reifung erfordert möglicherweise den Einsatz von Austrittshemmern, um den Austritt von Parasiten zu blockieren [50]. Darüber hinaus können zukünftige Vergleiche der Effizienz von Kurzzeitkulturen mit lebenden Isolaten ebenfalls aufschlussreich sein. Die MACS-Anreicherung reifer Parasiten (Trophozoiten, Schizonten und Gametozyten) zeigte eine relativ breite Verteilung der Parasitämien, der Anzahl der Parasiten pro Fläschchen und der prozentualen Erholung nach MACS. Die weniger als 100-prozentige Erholung kann auf die weite Verteilung der Parasitenstadien zurückzuführen sein, die während einer kurzfristigen Ex-vivo-Kultur beobachtet wurde (Abb. 3). Darüber hinaus zeigte die Anreicherung von Parasiten zwischen unabhängigen Tauwettern eine relativ gute Reproduzierbarkeit (Abb. 4D, E), was eine gewisse Vorhersage der Anzahl reifer Parasiten ermöglicht, die bei einem einzelnen Tauwetter erwartet wird, was für die Planung von Invasionstests von entscheidender Bedeutung wäre [17, 40, 51].

Während eine Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff bevorzugt wird, ist wenig über die Auswirkung des Wechsels zwischen flüssigem Stickstoff und Trockeneis/–80 °C Lagertemperaturen auf die Lebensfähigkeit von Plasmodium spp. bekannt. Parasiten [27]. Wenn Parasitenisolate speziell aus Endemiegebieten gesammelt werden, können die verfügbaren Optionen für die Lagerung von Proben während des Transports von der Sammelstelle zur Langzeitlagerung eingeschränkt sein. Die kurzfristige Lagerung von Isolaten bei verschiedenen Temperaturregimen zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit der Parasiten nach dem Auftauen und nach der Anreicherung, während bei Parasiten, die bei –80 °C gelagert wurden, nach 24 Stunden eine Verringerung der Parasitämie in der Kurzzeitkultur zu verzeichnen war wurde festgestellt (Abb. 5D). Ein Vergleich der Langzeitlagerung von Proben in flüssigem Stickstoff und bei –80 °C ergab jedoch keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Lagerung bei beiden Temperaturen, obwohl es möglich ist, dass die Lebensfähigkeit von Probe zu Probe variieren kann.

Vier verschiedene Kryokonservierungsmethoden für P. vivax wurden verglichen, und eine Methode sorgte für eine verbesserte Genesung und Reifung von Parasiten in kurzfristigen In-vitro-Kulturen. Mit dieser Methode wurde eine Biobank klinischer Isolate mit mehreren Einfrierungen pro Isolat erstellt und durch den Nachweis der Fähigkeit validiert, Parasiten nach dem Auftauen mit KCl-Percoll-Gradienten anzureichern und dafür zu sorgen, dass mindestens 60 % der Parasiten kurzfristig erfolgreich reifen vitro-Kulturen. Schließlich wurde die Lagerung von kryokonservierten Parasiten bei verschiedenen Temperaturen (Lagerung in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei −80 °C) getestet, aber zumindest für die Dauer dieser Studie gab es keine Hinweise auf Veränderungen in der Lebensfähigkeit von Parasiten, die in flüssigem Stickstoff gelagert wurden − 80 °C gefunden.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

rote Blutkörperchen

Magnetisch aktivierte Zellsortierung

Dimethylsulfoxid

Goa Medical College und Krankenhaus

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Die Finanzierung dieser Arbeit erfolgte durch das National Institutes of Health-Stipendium (NIH 5U19AI089688-13 an PKR).

Goa Medical College und Krankenhaus, Bambolim, Goa, 403202, Indien

Rashmi Dash, Ligia Pereira, Anjali Mascarenhas, Jayashri Walke, Anvily Almeida, Mezia Fernandes, Edwin Gomes und Anar Khandeparkar

Abteilungen für Chemie und globale Gesundheit, University of Washington, Seattle, WA, 98195, USA

Rashmi Dash, Ligia Pereira, Anjali Mascarenhas, Jayashri Walke, Mezia Fernandes, John White, Laura Chery-Karschney und Pradipsinh K. Rathod

Abteilung für Immunologie und Infektionskrankheiten, Harvard TH Chan School of Public Health, Boston, MA, 02115, USA

Kristen M. Skillman, Sheena Dass, Anvily Almeida, Manoj T. Duraisingh und Usheer Kanjee

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RD, LP, AM, JW, AA, MF, UK, SD sammelten Proben und generierten Daten. RD, KMS und UK analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. EG, JW, LCK, PKR, UK, KMS, RD, AK, SD und MDT interpretierten und überarbeiteten das Manuskript.

Korrespondenz mit Usheer Kanjee.

Das Probandenprotokoll und die Einverständniserklärungen für die Aufnahme von mit Plasmodium infizierten Patienten in diese Studie am Goa Medical College and Hospital (GMC) wurden von den Institutional Review Boards der Abteilung für Mikrobiologie und Infektionskrankheiten (DMID) am US National Institute of Allergy erstellt Infektionskrankheiten (Zulassung DMID 11-0074), der University of Washington (Zulassung 42271/1192) sowie dem Goa Medical College Hospital, Bambolim, Goa, Indien.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

. Zusammenfassung der veröffentlichten Plasmodium spp. Kryokonservierungsmethoden.

. Daten für die Abbildungen 1–5.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Dash, R., Skillman, KM, Pereira, L. et al. Entwicklung einer Plasmodium vivax-Biobank für funktionelle Ex-vivo-Assays. Malar J 22, 250 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04668-2

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Eingegangen: 17. März 2023

Angenommen: 07. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-023-04668-2

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