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Dec 21, 2023

Auswirkungen der Wirtsspezies auf die Mikrobiota-Zusammensetzung bei Phlebotomus- und Lutzomyia-Sandfliegen

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 310 (2023) Diesen Artikel zitieren Metrikdetails Blutsaugende Phlebotomin-Sandfliegen sind Überträger der einzelligen Parasiten Leishmania spp. Obwohl die

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 310 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Blutsaugende Phlebotomin-Sandmücken sind Überträger der einzelligen Parasiten Leishmania spp. Obwohl die Darmmikrobiota an einer Vielzahl biologischer und physiologischer Prozesse beteiligt ist und das Potenzial hat, die Vektorkompetenz zu verändern, ist wenig über die Faktoren bekannt, die die Zusammensetzung der Darmmikrobiota von Sandmücken verändern. Als einen wichtigen Schritt zur Lösung dieses Problems untersuchten wir den Einfluss der Wirtsspezies auf die Zusammensetzung der Darmbakterien bei Phlebotomus- und Lutzomyia-Sandfliegen, die unter den gleichen Bedingungen aufgezogen wurden.

Bakterielle 16S-rRNA-Genamplifikation und Illumina MiSeq-Sequenzierung wurden verwendet, um die gesamte Bakterienzusammensetzung von drei im Labor gezüchteten Sandmücken zu charakterisieren: Phlebotomus papatasi, Ph. duboscqi und Lutzomyia longipalpis.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Larven der drei Sandmückenarten fast die gleichen Mikroben beherbergten, jedoch unterschiedliche relative Häufigkeiten aufwiesen. Erwachsene Ph. papatasi und Ph. duboscqi zeigten ähnliche Mikrobiomzusammensetzungen, die sich von denen erwachsener Lu unterschieden. longipalpis. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Ph. papatasi und Ph. duboscqi Wirte für verschiedene Bakteriengattungen sind. Das Experiment wurde zweimal wiederholt, um die Genauigkeit zu verbessern und die Zuverlässigkeit der Daten zu erhöhen. Die gleichen Ergebnisse wurden auch dann erzielt, wenn eine unterschiedliche Zusammensetzung des Mikrobioms bei derselben Art festgestellt wurde, wahrscheinlich aufgrund der Verwendung unterschiedlicher Larvenfutterchargen.

Die vorliegende Studie liefert wichtige Erkenntnisse über die Rolle der Wirtsspezies im Darmmikrobengehalt verschiedener Sandmückenarten, die unter den gleichen Bedingungen gezüchtet werden, was ihre Anfälligkeit für eine Leishmania-Infektion beeinflussen kann.

Phlebotomine-Sandfliegen (Diptera: Psychodidae) sind blutfressende Insekten, die sich von einer Vielzahl von Wirten ernähren und eine Vielzahl von Krankheitserregern übertragen, die weltweit für die Entstehung von Krankheiten bei Menschen und Tieren verantwortlich sind. Von den mehr als 1000 Sandfliegenarten, die bisher validiert wurden, sind nur 10 % bekannte oder vermutete Überträger verschiedener Krankheitserreger, darunter Arboviren und Bakterien, aber sie gelten allgemein als Hauptüberträger von Leishmania, dem Erreger der Leishmaniose. eine vernachlässigte Tropenkrankheit [1, 2].

Sandfliegen leben in Gruppen und interagieren mit vielfältigen Mikrobiota. Es wurde gezeigt, dass mikrobielle Symbionten Schlüsselaspekte der Fitness ihres Insektenwirts beeinflussen [3,4,5,6]. Laut einer früheren Studie legten Lutzomyia longipalpis-Fliegen, die mit Kaninchenkot gefüttert wurden, eher Eier als Fliegen, die mit sterilisiertem Kot im Larvenstadium gefüttert wurden [3]. Darüber hinaus wurden bei Larven, die mit sterilem Kot gefüttert wurden, ein verzögertes Schlüpfen und geringere Überlebensraten beobachtet. Die Wiedereinführung eliminierter Bakterien bestätigte die ersten Ergebnisse und legte nahe, wie wichtig das Vorhandensein und die Spezifität von Bakterien für die Entwicklung von Sandmücken sind. Bakterien, die zum Stamm der Proteobakterien gehören, sind an der Ernährung des Insektenwirts beteiligt, indem sie atmosphärischen Stickstoff binden [7]. Umgekehrt kann der Wirt die mikrobielle Zusammensetzung auch bis zu einem gewissen Grad steuern, beispielsweise indem er die Nährstoffverfügbarkeit durch die Wahl der Ernährung, den Wirtsstoffwechsel [8] oder durch die Auslösung von Immunfaktoren [9] ändert. In diesem Zusammenhang wurde nachgewiesen, dass Sandfliegen aus tropischen Regionen, einschließlich Lu. longipalpis züchtet scheinbar in Böden, die mit zersetzten Blättern und anderen Abfällen angereichert sind, mit einer Vorliebe für Baumbasen. Darüber hinaus neigen Insekten dazu, Immunreaktionen auszulösen, um ein komplexes Gleichgewicht zwischen Akzeptanz und Ablehnung aufrechtzuerhalten und so ein friedliches Zusammenleben aufrechtzuerhalten [9].

Die natürliche Darmmikrobiota wird von erwachsenen Sandmücken aus verschiedenen Quellen erworben, darunter Zuckerrohrpflanzen und Blut von einer Vielzahl von Wirten, oder durch die Wiederbesiedlung des Darms durch Mikroben, die von auf der Erde lebenden Larvenstadien aufgenommen wurden [3, 10, 11, 12]. ,13]. Die meisten Bakterien im Larvenstadium unterliegen im Puppenstadium einem biologischen Abbau, und die mikrobielle Ladung wird unmittelbar nach dem Auftauchen des Erwachsenen deutlich reduziert [14, 15]. Weibliche Sandmücken infizieren sich durch die Aufnahme infizierter Zellen während der Blutmahlzeit und stellen eine interaktive Beziehung zwischen der mikrobiellen Gemeinschaft des Darms und dem Parasiten her, da der Entwicklungslebenszyklus von Leishmania innerhalb des Sandmückenvektors ausschließlich im Mittel- und Hinterdarm stattfindet Vorhandensein symbiotischer Bakterien [16, 17]. Die Darmbakteriengemeinschaft in Sandmücken kann je nach Bakterienart einen negativen oder positiven Einfluss auf die Entwicklung von Leishmanien haben [14, 17, 18, 19, 20, 21]. Weitere Studien zum Zusammenhang zwischen der Ablagerung von Bakterien bei Leishmania-infizierten Sandfliegenbissen und den klinischen Folgen der Leishmaniose haben gezeigt, dass die Darmmikroben von Lu. longipalpis werden neben Leishmania in die Haut des Wirts ausgeschieden, was die Infiltration von Neutrophilen auslöst und die parasitäre Installation erleichtert [22]. Früheren Studien zufolge wurde besonderes Augenmerk auf die Wechselwirkungen zwischen der mikrobiellen Gemeinschaft des Sandmückendarms und Parasiten gelegt, und ein Pool symbiotischer Mikrobiota wurde als potenzieller Kandidat für paratransgene oder biologische Ansätze zur Bekämpfung von Sandmücken angesehen Populationen [9, 11]. Frühere Studien haben gezeigt, dass Variationen in der Darmmikrobiota von Insekten durch viele Faktoren ausgedrückt werden können, einschließlich Wirtslebensraum, Ernährung, Entwicklungsstadium und Phylogenie, die alle zur Zusammensetzung der Darmmikrobiota von Insekten beitragen [23,24,25,26]. ,27,28]. Über die genetischen Wirtsfaktoren, die die Zusammensetzung der Darmmikrobiota von Sandmücken verändern, ist jedoch wenig bekannt, und nach unserem besten Wissen wurden keine Untersuchungen an diesen Insekten unter kontrollierten Bedingungen durchgeführt.

Mehrere Arten von Phlebotomus- und Lutzomyia-Sandfliegen, die geografisch in den Tropen verbreitet sind, wurden als Hauptüberträger von Leishmanienparasiten identifiziert [29]. Jede Sandmückenart besetzt eine spezifische ökologische Nische und hat einen klimaempfindlichen Lebenszyklus. Die Biologie ihrer Population wird durch eine Mischung aus abiotischen und biotischen Faktoren bestimmt, die unabhängig voneinander und durch Wechselwirkungen wirken. Die Sandfliegen Phlebotomus (Ph.) papatasi und Phlebotomus (Ph.) duboscqi sind altweltliche Überträger von Leishmania (L.) major, dem ätiologischen Erreger der kutanen Leishmaniose. Im Gegensatz dazu Lu. longipalpis-Sandfliegen sind die wichtigsten natürlichen Überträger der Parasiten Leishmania (L.) infantum, die für die Übertragung der viszeralen Leishmaniose in der Neuen Welt verantwortlich sind. Diese drei Phlebotomin-Sandfliegen sind in verschiedenen internationalen Labors weit verbreitet und werden als lebende Vektormodelle in einer Vielzahl von Forschungsprojekten verwendet.

Ziel der vorliegenden Studie war es zu testen, ob Wirtsarten die Zusammensetzung der Darmmikrobiota der drei oben genannten Sandfliegenarten beeinflussen, die unter den gleichen Bedingungen aufgezogen wurden, und so die durch Ernährung und Umweltfaktoren verursachten Unterschiede minimieren. Da sich die Merkmale jeder Art bei den Sandmücken Phlebotomus und Lutzomyia unterscheiden, haben wir vorhergesagt, dass es auch zu Veränderungen in ihren Mikrobiomen kommen würde.

Es wurden drei im Labor gezüchtete Sandmückenarten verwendet: zwei Altweltarten [Phlebotomus papatasi aus Jordanien (PPJO) und Ph. duboscqi aus Mali (PDMA)] und eine Neuweltart [Lu. longipalpis von Jacobina (LLJB)]. Diese Stämme wurden von der Vector Molecular Biology Section, Laboratory of Malaria and Vectors, USA, bezogen und in der Abteilung für Medizinische Zoologie der Jichi Medical University, Japan, aufbewahrt. Sie wurden > 5 Jahre lang unter den gleichen Laborbedingungen aufgezogen, um den möglichen Einfluss von Umweltfaktoren und Ernährung zu minimieren. Im Labor wurden die Sandfliegen in Netzkäfigen (30 × 30 × 30 cm) bei 26 ± 1 °C, 80–90 % Luftfeuchtigkeit und einer Photoperiode von 12:12 (hell:dunkel) gehalten. Die Sandfliegen hatten Zugang zu einem Stück Baumwolle, das in 30 %iger Saccharoselösung getränkt war. Nicht mit Blut gefütterte Weibchen wurden BALB/c-Mäusen (Japan SLC, Shizuoka, Japan) als Blutquelle ausgesetzt. Die mit Blut gefütterten Weibchen wurden zur Eiablage einzeln in Fläschchen überführt. Die Eier wurden in einen 150-ml-Polystyrolbehälter gelegt, der mit 2 cm Gips am Boden gefüllt war (Eierablagebehälter) und im Dunkeln bei 26 ± 1 °C und 80–90 % Luftfeuchtigkeit aufbewahrt. Kurz vor dem Schlüpfen wurde eine sehr kleine Menge Futter auf mehrere Stellen in der Nähe der Eier gestreut. Larvenfutter wurde durch Mischen von frischem Kaninchenkot und Kaninchenfutter im Verhältnis 1:1 zubereitet, das 4 Wochen lang bei 26 °C in einer dunklen Kammer fermentiert, an der Luft getrocknet und zu einem Pulver gemahlen wurde [30]. Bemerkenswert ist, dass zwei verschiedene Lebensmittelchargen in unterschiedlichen Zeitabständen getrennt zubereitet wurden, was möglicherweise zu Veränderungen in den Bakteriengemeinschaften geführt hat.

Weibliche Sandfliegen wurden experimentell infiziert, indem sie sich durch eine Kükenhautmembran von hitzeinaktiviertem Blut ernährten, das 106 L.-major-Promastigoten pro Milliliter enthielt. Die Lebensfähigkeit des Parasiten wurde nach der Blutfütterung überprüft. Angeschwollene Sandfliegen wurden dann abgetrennt und unter Standardbedingungen bei 26 °C gehalten [30]. Die Promastigoten werden bei der mikroskopischen Untersuchung von Darmproben drei Tage nach der Blutmahlzeit beobachtet.

Bakterien-DNA wurde aus allen acht Larven im Stadium L4 und einem Pool von acht präparierten Mitteldärmen erwachsener Tiere der drei im Labor gezüchteten Sandmückenarten in unterschiedlichen Zeitintervallen extrahiert: 1 Woche nach der Freilassung, vor dem Füttern und 3 und 7 Tage nach der Fütterung -Fütterung. Das gleiche Probensammelprotokoll wurde befolgt, um DNA aus infizierten und nicht infizierten, mit Blut gefütterten Sandmücken 3 Tage nach der Fütterung zu extrahieren. Ganze Sandfliegenproben wurden zunächst mit destilliertem Wasser, anschließend mit 70 %igem Ethanol gewaschen und dreimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und schließlich mit doppelt destilliertem Wasser gespült. Nach dem Waschen wurden die Eingeweide der Sandmücken vorsichtig unter einem Stereomikroskop auf sterilisierten Einweg-Objektträgern mit sterilen Insektennadeln präpariert.

Gepoolte Proben wurden in 0,5 ml Micrewtube® mit 250 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Kochsalzlösung homogenisiert. Ungefähr 0,5 g Zirkonoxid-/Silikatkügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 mm (BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA) wurden in die Extraktionsröhrchen gegeben, um mikrobielle Zellen mithilfe eines ShakeMan6-Perlenzerkleinerers (Bio Medical Science, Tokio, Japan) mechanisch zu zerkleinern [31, 32]. Zerkleinerte Zellen wurden bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, um einen Niederschlag aus Zelltrümmern zu erhalten, und 200 µl des Überstands wurden einer DNA-Isolierung unterzogen. Genomische DNA wurde aus Sandfliegenbecken mit dem ReliaPrep DNA Cleanup and Concentration System Kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Das gleiche Protokoll wurde befolgt, um bakterielle DNA aus dem Larvenfutter zu extrahieren.

Zur Amplifikation der variablen Region (V3–V4) des 16S-rRNA-Gens wurden zwei PCR-Schritte durchgeführt. Im ersten Schritt wurde die PCR-Amplifikation in einem Thermocycler nach der DNA-Extraktion unter Verwendung von Primern durchgeführt, die auf die V3- und V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens abzielten. Die folgenden Primer wurden verwendet, um die hypervariablen Regionen V3–V4 des 16S-rRNA-Gens zu amplifizieren: Vorwärtsprimer: (5ʹTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGT ATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3ʹ) und Rückwärtsprimer (5ʹGTCTCGT GGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3ʹ). Diese Regionen wurden durch das Illumina-Protokollhandbuch genehmigt [33] und lieferten qualitativ hochwertige Sequenzdaten, wie zuvor beschrieben [34]. Die PCR-Amplifikation wurde mit 35 Denaturierungszyklen (95 °C, 30 s), Annealing (55 °C, 30 s) und Polymerisation (72 °C, 30 s) unter Verwendung der AmpliTaq Gold 360 DNA-Polymerase durchgeführt. Indexprimer wurden verwendet, um jeden Teil des PCR-Produkts erneut zu amplifizieren und Amplikonbibliotheken für die Illumina-Sequenzierung zu generieren (33). Die amplifizierten Produkte wurden einer Elektrophorese auf einem 1,5 %igen Agarosegel unterzogen. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung der Illumina MiSeq-Plattform mit MiSeq Reagent Kit Version 3 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt.

Die Darmbakterien in Sandfliegen wurden durch qPCR mit TB Green Fast Mix (TOYOBO Co., Ltd., Osaka, Japan) unter Verwendung eines Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) quantifiziert. Als Ziel diente das bakterielle 16S-rRNA-Gen und als Referenz Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH). Die Primersequenzen waren 5ʹ-ACHCCTACGGGDGGCWGCAG-3ʹ (16S-q-337F) und 5ʹ-GTDTYACCGCGGYTGCTGGCAC-3ʹ (16S-q-514R) für die Amplifikation des bakteriellen 16S-rRNA-Gens sowie 5ʹ-TTCGCAGAAGACAGTGATGG-3ʹ (Lugapdh-qF) und 5ʹ-CCCTTCATCGGTCTGGACTA-3ʹ (Lugapdh-qR) und 5ʹ-CGACTTCAACAGCA ACTCCCACTCTTCC-3ʹ (Phgapdh-qF) und 5ʹ-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACT CCTT-3ʹ (Phgapdh-qR) für das Gapdh-Gen [35, 36]. Die relativen Mengen an 16S-rRNA-Genen wurden mit der ∆∆Ct-Methode unter Verwendung von GAPDH als Referenz bestimmt.

Die ITS1-Region des Pilzes wurde unabhängig voneinander mithilfe von zwei PCR-Schritten amplifiziert, wie oben für bakterielle DNA beschrieben. Angesichts der verschiedenen Arten von Verzerrungen (Spezifität gegenüber Pilzen, Fehlpaarungen, Länge und Taxonomie) wurden verschiedene Primerkombinationen gleichzeitig verwendet, die auf verschiedene Teile der ITS-Region abzielen, wie im Illumina-Protokollhandbuch vorgeschlagen [37]. Die ITS-Regionen wurden mit der Illumina MiSeq-Plattform und dem MiSeq-Reagenzienkit Version 3 (Illumina) sequenziert.

Die von der MiSeq-Plattform generierten Lesevorgänge (600 Zyklen, Paired-End-Format) wurden als FASTQ-Dateien zum Importieren in Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2) (Version 2020.2.0) exportiert [38]. Die Paired-End-Lesevorgänge wurden mit dem DADA2-Programm im QIIME2-Plugin gekürzt und zusammengeführt. Sequenzen wurden vom QIIME2-Programm in Amplikonsequenzvarianten (ASVs) geclustert. Die OTUs wurden basierend auf dem Datensatz SILVA Version 138 [39] mit einer Sequenzidentität von 99 % annotiert.

Die Prinzipkoordinatenanalyse (PCoA) zur Bray-Curtis-Unähnlichkeit wurde verwendet, um die Beta-Diversitätsindizes von Bakteriengemeinschaften unter Sandfliegen anzuzeigen [40]. Die Gruppensignifikanz-Beta-Diversitätsindizes wurden mit QIIME2-Plugins unter Verwendung einer permutationellen multivariaten Varianzanalyse (PERMANOVA) berechnet. Ein P-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

In dieser Studie haben wir den Mikrobiota-Gehalt von drei Sandmückenarten charakterisiert, die unter den gleichen Bedingungen gezüchtet wurden, wobei wir die durch Ernährung und Umweltfaktoren verursachten Unterschiede minimierten, um zu testen, ob die Wirtsarten die Bakterienvielfalt beeinflussen. Um die in der Mikrobiota des Mitteldarms vorhandenen Bakterienlinien zu charakterisieren, führten wir eine Multiplex-Illumina-Sequenzierung der hypervariablen Regionen V3 und V4 des 16S-rRNA-Gens durch. Das Experiment wurde zweimal wiederholt (Experiment 1 und 2), um genaue und zuverlässige Daten zu erhalten, und wenn die Identifizierung von Bakteriengattungen fehlschlug, wurde eine Analyse auf Familienebene durchgeführt. Die dominantesten Sequenzen in den beiden wiederholten Experimenten gehörten zu zwei Bakterienfamilien, Rhizobiaceae und Yersiniaceae, die zum Stamm der Proteobacteria gehören.

Die Taxa der Mikrobiota auf Familien- und Gattungsebene sind in Abb. 1a (Experiment 1) dargestellt. Die Larven der Phlebotomus- und Lutzomyia-Arten beherbergten ähnliche Mikroben, die durch unterschiedliche relative Häufigkeiten vertreten waren. Basierend auf den relativen Häufigkeitsdaten und der Beta-Diversitätsanalyse lagen Ph. papatasi und Ph. duboscqi nahe beieinander und von Lu entfernt. longipalpis (Zusatzdatei 1: Abb. S1a; PERMANOVA, Df = 2, P = 0,347). Lutzomyia longipalpis enthält mehr Sumerlaea und weniger Sporosarcina als Ph. papatasi und Ph. duboscqi, die zu Sumerlaeaceae bzw. Planococcaceae gehören (Abb. 1a). Darüber hinaus wurden in gebrauchtem Larvenfutter zwei Hauptbakteriengattungen identifiziert, darunter Pseudomonas und Nocardiopsis (zu den Familien Pseudomonadaceae bzw. Nocardiopsaceaea gehörend), die nur in einigen Sandmücken-Mikrobiota vorkommen. Darüber hinaus wuchsen Bakterien mit geringen Prozentsätzen bei einigen Larven und erwachsenen Sandmücken (Tissierella, Sporosarcina, Corynebacterium, Xanthomonadaceae) leicht. Die Darmbakteriengemeinschaften erwachsener Ph. papatasi und Ph. duboscqi waren 3 und 7 Tage nach der Fütterung ähnlich und wurden von Rhizobiaceae (99,3 % für Ph. papatasi und 95,3 % für Ph. duboscqi) und Serratia aus der Familie der Yersiniaceae dominiert ( 99,1 % für Ph. papatasi bzw. 99,9 % für Ph. duboscqi (Abb. 1a). Die Rhizobiaceae-Familie wurde 7 Tage nach der Freilassung und vor der Fütterung auf die beiden frisch freigelassenen Ph. papatasi (99,4 %) und Ph. duboscqi (44,2 %) verteilt, wohingegen Ph. duboscqi Individuen bestimmter Gattungen umfasste [Tissierella (9,8 %), Corynebacterium (10,1 %) und Paracoccus (12,4 %), die zu den Familien Tissierellaceae, Corynebacteriaceae bzw. Rhodobacteraceae gehören]. In dieser Studie lagen die mikrobiellen Gemeinschaften bei Arten der Gattung Phlebotomus nahe beieinander, während die bei Lu. longipalpis waren weit voneinander entfernt. Drei Hauptbakteriengattungen wurden im Darm der letzten Sandfliegenart, frisch freigesetzt und 3 bzw. 7 Tage nach der Fütterung, identifiziert, darunter Achromobacter (84,3 %), Staphylococcus (46,9 %) und Tsukamurella (96,2 %). gehören zu den Familien Alcaligenaceae, Staphylococcaceae und Tsukamurellaceae.

a Mikrobiota-Taxa auf Familien- und Gattungsebene von drei im Labor gezüchteten Sandfliegen in Experiment 1. b Mikrobiota-Taxa auf Familien- und Gattungsebene von drei im Labor aufgezogenen Sandfliegen in Experiment 2. P, Phlebotomus papatasi; D, Ph. duboscqi; L, Lutzomyia longipalpis; L4, Larvenstadium 4; F, Essen; BBF, vor der Blutfütterung; 3d ABF, 3 Tage nach Blutfütterung; 7d ABF, 7 Tage nach der Blutfütterung

Die Darmmikrobiota wurde mittels qPCR quantifiziert, um die Veränderungen in den Bakteriengemeinschaften in verschiedenen Sandmücken zu bestimmen (Experiment 1). Unsere Ergebnisse zeigten, dass die mikrobielle Belastung nach dem Auftauchen der Erwachsenen in Ph. papatasi deutlich abnahm (≃ sechsmal). Allerdings stieg die Bakterienzahl nach der Fütterung (mit Blut) bei Ph. papatasi und Ph. duboscqi signifikant an (≃ drei- bzw. zweifach), und fast die gleiche Bakterienladung blieb 7 Tage nach der Blutfütterung erhalten (Zusatzdatei 2: Abb . S2a).

Die Taxa der Bakteriengemeinschaften auf Familien- und Gattungsebene sind in Abb. 1b (Experiment 2) dargestellt. Basierend auf den Diversitätsdaten waren die Bakteriengemeinschaften der drei Sandfliegenlarvenarten sehr ähnlich. Wie in Experiment 1 aufgezeichnet, waren die erwachsenen Ph. papatasi und Ph. duboscqi nahe beieinander und weit entfernt von der erwachsenen Lu. Longipalpis (Zusatzdatei 1: Abb. S1b; PERMANOVA, Df = 2, P = 0,004). Im Vergleich zum ersten Experiment wurde in den Larvenfuttermitteln der beiden miteinander verbundenen Chargen eine vollständige Veränderung der Bakterienzusammensetzung beobachtet, wahrscheinlich aufgrund einer bakteriellen Kontamination während der Verarbeitung und Handhabung. Xanthomonadaceae- und Sphingobacteriaceae-Familien waren die wichtigsten Bakterien, die in der Nahrung identifiziert wurden, aber in der Sandfliegen-Mikrobiota nicht vorhanden waren. Bei einigen Larven und erwachsenen Sandmücken (Glycomyces, Rhizobiaceae) wuchsen jedoch geringe Prozentsätze an Bakterien. Bei den Erwachsenen waren Rhizobiaceae und Yersiniaceae (Serratia) die dominierenden Mikrobenfamilien in Experiment 2. Rhizobiaceae kamen in allen erwachsenen Ph. papatasi und Ph. duboscqi sehr häufig vor und fehlten in Lu vollständig. longipalpis, bei dem Yersiniaceae (99,3 % bzw. 99,8 % 3 bzw. 7 Tage nach der Fütterung) und Stenotrophomonas der Xanthomonadaceae (96,7 % bei Sandfliegen vor der Fütterung) fast alle Mikrobiota-Gemeinschaften ausmachten.

In Experiment 2 verringerte sich die mikrobielle Belastung nach dem Auftauchen der Erwachsenen in Ph. papatasi deutlich (≃ 6-fach). Allerdings stieg die Bakterienzahl 3 Tage nach der Blutfütterung an (≃2-, 18- bzw. 7-faches bei Ph. papatasi, Ph. duboscqi und Lu. longipalpis) und sank wieder ab, um am 7. Tag danach eine sehr niedrige Bakterienzahl zu erreichen -Fütterung (Zusatzdatei 2: Abb. S2b).

Die Diversität des Sandfliegen-Darmmikrobioms wurde zwischen der Kontrolle und infizierten Sandfliegen 3 Tage nach der Blutfütterung verglichen (Abb. 2). Wie oben erwähnt, wurde ein Teil der Bakteriengattungen und -familien von den beiden eng verwandten Phlebotomus-Arten gemeinsam genutzt, während bei Lu eine besondere Zusammensetzung beobachtet wurde. longipalpis. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Diversität und Häufigkeit der Darmbakteriengemeinschaften zwischen Leishmania-infizierten und nicht infizierten Sandmücken in den Gattungen Phlebotomus und Lutzomyia sehr unterschiedlich waren (Abb. 2).

Bakterienzusammensetzung von nicht infizierten und infizierten im Labor gezüchteten Sandmücken in Experiment 1. P, Phlebotomus papatasi; D, Ph. duboscqi; L, Lutzomyia longipalpis; Uninf, nicht infiziert; Inf, infiziert

Die meisten im Darm des Ph. papatasi-Wirts vorhandenen Bakterien gehörten zu Rhizobiaceae, deren Anteil von 94,3 % in der Kontrollgruppe auf 12,2 % in der infizierten Gruppe zurückging. Allerdings stieg die Zahl der Anaplasmataceae dramatisch von 1,6 % bei nicht infizierten Personen auf 86,8 % bei infizierten Personen. In Ph. duboscqi wurden drei Bakteriengattungen identifiziert, die zu zwei Familien gehören (Abb. 2). Die relative Häufigkeit von Rhizobiaceae (unbestimmt und Ochrobactrum-Gattungen) stieg von 22,8 % bei nicht infizierten Personen auf 70,6 % bei infizierten Personen, während die von Yersiniaceae von 77,1 % auf 29,12 % zurückging. Im Gegensatz dazu ist die Bakterienzusammensetzung von Lu. longipalpis veränderte sich zwischen der Kontrollgruppe und der infizierten Gruppe vollständig, mit Ausnahme der Gattung Staphylococcus (Staphylococcaceae), die nahezu die gleiche Häufigkeit beibehielt (14,2 % bzw. 25,7 % in der nicht infizierten bzw. infizierten Gruppe) (Abb. 2).

Da die Darmmikrobiota die Parasitenentwicklung beeinflussen kann, wurden quantitative Veränderungen in den Bakteriengemeinschaften bewertet. Die Darmmikrobiota wurde durch qPCR für nicht infizierte und infizierte Sandmücken zu unterschiedlichen Zeitpunkten quantifiziert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich die Bakterienlast zwischen beiden Sandmückengruppen leicht oder deutlich ändern kann, was auf eine quantitative Interaktion mit Leishmania-Parasiten schließen lässt (Zusatzdatei 3: Abb. S3).

Wie in Abb. 3 dargestellt, waren Chaetomium und Microascus die Hauptpilzgattungen in den Larven von Sandmückenarten. Die Pilzzusammensetzung der Larvennahrung wurde von Circinella (32,7 %), Cephaliophora (30,2 %) und Aspergillus (19,4 %) dominiert, jedoch nicht von Sandmückenpilzen. Darüber hinaus ist die Gattung Meyerozyma der einzige Pilz, der in allen erwachsenen Sandmücken vorkommt, unabhängig von der Art. Allerdings wurde die Pilzzusammensetzung der Kontroll- und infizierten Sandmücken überprüft und es konnte kein Unterschied festgestellt werden. Meyerozyma war die einzige Gattung, die in beiden Gruppen identifiziert wurde.

Pilzzusammensetzung von drei im Labor gezüchteten Sandfliegen. P, Phlebotomus papatasi; D, Ph. duboscqi; L, Lutzomyia longipalpis; L4, Larvenstadium 4; F, Essen; BBF, vor der Blutfütterung; 3d ABF, 3 Tage nach Blutfütterung; 7d ABF, 7 Tage nach der Blutfütterung

Mikrobiota-Gemeinschaften wurden in Phlebotomus- und Lutzomyia-Sandmücken bestimmt, die unter den gleichen Bedingungen aufgezogen wurden, und die Auswirkungen der Wirtsspezies auf die Bakterienstruktur wurden in der vorliegenden Studie untersucht. Frühere Studien an Käfern und Mücken zeigten, dass Mikrobiome je nach Ernährung oder Probenahmeort ihrer Wirte variieren [26, 41]. Die in dieser Studie verwendeten Sandmücken lebten > 5 Jahre unter den gleichen Bedingungen und man ging daher davon aus, dass andere Variablen wie Ernährung, Temperatur und Luftfeuchtigkeit das Mikrobiom nicht stark beeinflussen würden. Insbesondere sind die Weibchen von Ph. papatasi und Ph. duboscqi altweltliche Arten, die morphologisch und genetisch eng verwandt sind, und beide sind bekanntermaßen Überträger von L. major [42]. Im Gegensatz dazu Lu. longipalpis ist eine Neuweltart und natürlicher Überträger von Leishmania infantum-Parasiten. Die Trennung zwischen primitivem Phlebotomus und Lutzomyia erfolgte vor etwa 200 Millionen Jahren [43].

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Phylogenie des Wirts ein starker Treiber für die Mikrobiota-Struktur im Insektendarm ist [27, 44, 45]. Kürzlich wurde vermutet, dass der Wirtsgenotyp der Hauptmodulator der Wildpopulation der Darmmikrobiota der Phlebotomus-Sandfliege ist [28]. In diesem Zusammenhang untersuchten wir die Rolle der Wirtsarten in der Mikrobiota-Diversität von Leishmania-freien Sandmückenarten der Alten und Neuen Welt, die unter den gleichen Bedingungen gezüchtet wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass erwachsene Ph. papatasi und Ph. duboscqi eine ähnliche Mikrobiomzusammensetzung aufweisen, die sich von der des erwachsenen Lu unterscheidet. longipalpis. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Ph. papatasi und Ph. duboscqi Wirte für verschiedene Bakteriengattungen sind. Es wurde gezeigt, dass die Mikrobiomzusammensetzung positiv mit der phylogenetischen Verwandtschaft zwischen Wirten korreliert, d. h. eng verwandte Wirtsarten neigen dazu, mehr gemeinsame Bakteriengruppen zu besitzen als entfernt verwandte Wirte [46]. Diese Ergebnisse stützen unsere Hypothese, dass Wirtsarten die Zusammensetzung der prokaryotischen Mikrobiota in Sandmücken bestimmen.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass Proteobakterien der Hauptstamm in den untersuchten Proben waren. Diese Ergebnisse stimmen mit den Daten einer aktuellen Metaanalyse von mit Sandfliegen assoziierten Bakterien überein, die ergab, dass > 57 % bzw. 47 % der identifizierten Bakterien zum Proteobacteria-Stamm der Sandmückenarten der Neuen bzw. Alten Welt gehörten [47] . Die unterschiedliche Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften von Ph. papatasi und Ph. duboscqi wurde durch zwei ASVs der Rhizobiaceae und Yersiniaceae (Gattung Serratia) bestimmt. Allerdings, Lu. longipalpis zeichnete sich durch eine spezifische Bakterienstruktur aus, die von Achromobacter, Tsukamurella, Staphylococcus und Stenotrophomonas dominiert wurde. Weitere Studien sind erforderlich, um den Beitrag verschiedener Bakterientaxa zu den Lebensmerkmalen von Sandmückenarten zu untersuchen und dabei die gegensätzlichen Belege für die Rolle endosymbiotischer Bakterien bei der Infektiosität und dem Überleben von Leishmanien zu berücksichtigen [14, 17].

Bei einigen Larven und Erwachsenen wuchsen einige Bakterien aus Sandfliegenfutter leicht. Die beobachteten Unterschiede in den Mikrobiota-Gemeinschaften zwischen dem Darm und der verwendeten Nahrung können durch Verhaltensanpassungen von Insekten erklärt werden, die die dominanten Darmbakterien-Taxa weiter fördern, einschließlich Koprophagie (Essen von Kot), Trohallaxis (die Übertragung von Nahrung oder anderen Darmflüssigkeiten durch den Mund). (zu-Mund- oder Anus-zu-Mund-Fütterung) und mütterliches Verschmieren des Bakteriendarms auf der Eierschale, der anschließend vom Nachwuchs verzehrt wird [48, 49]. Darüber hinaus können Wirtssandmücken die physikalisch-chemischen Bedingungen des Darms beeinflussen, was zu einem unterschiedlichen Bakterienwachstum führen kann [50]. Basierend auf unseren Ergebnissen scheinen die Arten der Bakteriengewinnung und des Bakterienwachstums bei Phlebotomus-Arten, die sich von Lu unterscheiden, ähnlich zu sein. longipalpis.

Dieses Experiment wurde zweimal wiederholt, um unsere Hypothese zur Phylogenie des bakteriellen Wirts genau zu testen, und es wurde eine unterschiedliche Zusammensetzung des Mikrobioms unter denselben Arten identifiziert. Die Verwendung verschiedener Chargen von Larvenfutter mit unterschiedlichem Bakteriengehalt könnte den vorliegenden Befund erklären, auch wenn bei einigen Larven und Erwachsenen nur wenige Bakterien aus dem Futter leicht wuchsen. Letztere können mit den Wirtsmikroorganismen interagieren und die Struktur der Mikrobiota vollständig verändern. Unsere Ergebnisse stimmen mit denen früherer Studien überein, die darauf hindeuten, dass die Ernährung eine Rolle bei der Zusammensetzung der Darmbakterien bei Insekten spielt [26]. Es wurde gezeigt, dass die interspezifischen Interaktionen zwischen Mikroorganismen, durch die Mikroben um Nährstoffe und Raum konkurrieren, den Mikrobiota-Gehalt von Insekten verändern können [51, 52]. Theoretische Syntheseforschung hat die Bedeutung der Wirtskontrolle (d. h. Partnerwahl und -treue) für die Aufrechterhaltung wechselseitiger Assoziationen vorgeschlagen [53, 54]. Es muss jedoch erwähnt werden, dass die bemerkenswerte Divergenz in der Mikrobiota-Struktur zwischen den beiden biologischen Replikaten möglicherweise auch eine große individuelle Variation in der Bakterienzusammensetzung der untersuchten Sandmückenarten aufzeigt, und wir schlagen außerdem vor, dass die Bakteriengemeinschaften nur lose und vorübergehend sind mit diesen Sandfliegen in Verbindung gebracht. Da wir in unserem Experiment Proben gepoolt haben, sollten weitere Studien die mikrobiellen Gemeinschaften einzelner Sandmücken untersuchen, um Veränderungen zwischen Individuen zu beurteilen.

Weibchen zweier Sandmückengattungen, Phlebotomus und Lutzomyia, sind von medizinischer Bedeutung, da sie die einzigen etablierten Überträger von Leishmania-Arten sind, die für den Menschen pathogen sind [55]. In der vorliegenden Studie wurden Bakteriengemeinschaften in nicht mit Leishmanien infizierten und infizierten Sandfliegen identifiziert und mithilfe der Illumina MiSeq-Sequenzierung verglichen. Es wurde bereits berichtet, dass das Darmmikrobiom je nach Bakterienart die Parasitenaktivität entweder verstärkt oder hemmt und somit das Potenzial hat, die Vektorkompetenz zu verändern [56]. Die vorliegende Studie zeigte, dass die Gattung Serratia in infizierten Ph. duboscqi und Ph. papatasi signifikant zurückging und vollständig verschwand, was möglicherweise die Entwicklung von L. main begünstigte. Tatsächlich wurde gezeigt, dass diese Bakteriengattung L. infantum und Leishmania braziliensis negativ beeinflusst, indem sie die Lyse der Zellmembran des Parasiten induziert und mit Lu koinfiziert. longipalpis in vitro [57, 58]. Die antagonistische Interaktion zwischen Bakterien und Leishmania-Parasiten fungierte als prägende Kraft für die Gemeindeversammlung. Jüngste Arbeiten haben sich mit überraschenden Ergebnissen darauf konzentriert, wie residente Mikrobiota die Leishmania-Infektion des Vektors beeinflussen können. Grundsätzlich wurde festgestellt, dass die Sandfliegen-Mikrobiota für die Entwicklung und Übertragung von Leishmanien von grundlegender Bedeutung ist. Eine Veröffentlichung legt nahe, dass die Entfernung der Mikrobiota die Osmolarität der Darmumgebung verändert und somit schädlich für die Entwicklung von Leishmanien ist [59]. Da wir nicht genau wissen, welche Mechanismen für diese Interaktion/Abhängigkeit zwischen Leishmanien und Mikrobiota in vitro-Kulturen und in vivo verantwortlich sind, kann dies als offenes Forschungsfeld betrachtet werden.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die mikrobielle Belastung nach dem Auftauchen der erwachsenen Tiere deutlich verringert war und nach der Blutfütterung deutlich zunahm. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Daten überein, die darauf hindeuten, dass die mikrobielle Ladung nach dem Schlüpfen des Erwachsenen sofort und deutlich abnimmt [14, 15] und nach der Bluternährung zunimmt [15, 17]. Darüber hinaus lässt der Unterschied in der Bakterienbelastung zwischen nicht infizierten und infizierten Sandmücken auf eine quantitative Interaktion mit Leishmania-Parasiten schließen. Es wurde bereits nachgewiesen, dass jede Manipulation, die die Größe/Vielfalt der natürlichen Mikrobiota verringert, die Fähigkeit von Leishmania beeinträchtigt, Infektionen bei Sandmücken hervorzurufen [17, 60]. Studien, die die Bakterienlast separat untersuchten, konnten jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Infektionsraten feststellen [34].

Dies ist der erste Bericht über die Darmbakterien-Mikrobiome von Phlebotomus- und Lutzomyia-Sandfliegen, die über viele Generationen hinweg unter den gleichen Bedingungen gezüchtet wurden. Unsere Analyse ergab, dass erwachsene Ph. papatasi und Ph. duboscqi eine ähnliche Mikrobiomzusammensetzung aufweisen, die sich von der des erwachsenen Lu unterscheidet. longipalpis, was auf die Rolle der Phylogenie bei der Zusammensetzung der Darmmikrobiota von Insekten hinweist. Das Experiment wurde zweimal wiederholt und es wurden die gleichen Schlussfolgerungen zur Phylogenie des Wirts gezogen, selbst wenn eine unterschiedliche Zusammensetzung des Mikrobioms bei derselben Art festgestellt wurde. Es wurden jedoch Unterschiede in der Bakterienvielfalt und Häufigkeit der Darmbakteriengemeinschaften zwischen nicht infizierten und infizierten Sandmücken berichtet. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten sich zukünftige Studien auf die Rolle dieser Mikroorganismen in der Biologie von Sandfliegenarten konzentrieren und dabei die gegensätzlichen Beweise für die Rolle der nachgewiesenen Bakterien bei der Infektiosität und dem Überleben von Leishmanien berücksichtigen.

Die Mikrobiomsequenzdaten in dieser Studie wurden in der NCBI/GenBank/DDBJ-Datenbank unter SAMN35318066–SAMN35318107 registriert.

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Referenzen herunterladen

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Diese Studie wurde vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur und Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) finanziell unterstützt (Zuschussnummern 18K19460, 20H03155 und 21K19193).

Abteilung für Medizinische Zoologie, Abteilung für Infektion und Immunität, Jichi Medical University, Shimotsuke, Tochigi, 329-0498, Japan

Ahmed Tabbabi, Daiki Mizushima, Daisuke S. Yamamoto und Hirotomo Kato

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Konzeptualisierung, AT, DM und HK; Methodik, AT, DM, DSY und HK; Software, DM; Validierung, AT, DM und HK; Formale Analyse, DM; Untersuchung, AT; Ressourcen, DM, DSY, AT und HK; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, AT und HK; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, AT, DM, DSY und HK; Visualisierung, DM; Aufsicht, HK; Projektverwaltung, AT und HK; Finanzierungseinwerbung, HK. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Hirotomo Kato.

Alle Verfahren wurden gemäß den von der Jichi Medical University genehmigten ethischen Richtlinien durchgeführt (Genehmigungsnummern: Tierversuch, 20003-01; DNA-Experiment, 21–56).

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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A. Die relativen Bakterienmengen von drei im Labor gezüchteten Sandmücken, Experiment 1. b. Die relativen Bakterienmengen von drei im Labor gezüchteten Sandmücken, Experiment 2.

Die relativen Bakterienmengen von nicht infizierten und infizierten drei im Labor gezüchteten Sandmücken

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 24. Mai 2023

Angenommen: 21. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05939-2

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