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Jun 08, 2023

Die Identifizierung und Verfolgung mobiler Elemente in sich entwickelnden Kompostgemeinschaften liefert Einblicke in das Nanobiom

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 90 (2023) Diesen Artikel zitieren 335 Zugriffe 8 Details zu altmetrischen Metriken Die mikrobielle Evolution wird durch schnelle Veränderungen im Geninhalt angetrieben, die durch horizontale Prozesse vermittelt werden

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 90 (2023) Diesen Artikel zitieren

335 Zugriffe

8 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die mikrobielle Evolution wird durch schnelle Veränderungen im Geninhalt vorangetrieben, die durch horizontalen Gentransfer (HGT) vermittelt werden. Während mobile genetische Elemente (MGEs) wichtige Treiber des Genflusses sind, ist das Nanobiom – der Zoo darwinistischer Replikatoren, die auf mikrobielle Wirte angewiesen sind – nach wie vor nur unzureichend charakterisiert. Neue Ansätze sind notwendig, um unser Verständnis über MGEs, die einzelne Populationen prägen, und deren Auswirkungen auf komplexe mikrobielle Gemeinschaften zu erweitern. Eine bioinformatische Pipeline (xenoseq) wurde entwickelt, um metagenomische Proben aus sich parallel entwickelnden mikrobiellen Konsortien zu vergleichen, um die MGE-Verbreitung zu identifizieren. Diese Pipeline wurde auf Kompostgemeinschaften angewendet, in denen MGEs regelmäßig gemischt wurden. Wir zeigen, dass Xenoseq die Bewegung von MGEs von demografischen Veränderungen in der Zusammensetzung der Gemeinschaft unterscheiden kann, die sonst die Identifizierung erschweren würden, und demonstrieren darüber hinaus die Entdeckung verschiedener unerwarteter Entitäten. Von besonderem Interesse war ein Nanobakterium des Kandidatenstamms Radiation (CPR), das eng mit einer in Grundwasserökosystemen identifizierten Art (Candidatus Saccharibacterium) verwandt ist und offenbar eine parasitäre Lebensweise hat. Wir heben auch ein weiteres produktives mobiles Element hervor, ein 313-kb-Plasmid, das von einer Cellvibrio-Linie gehostet wird. Es wurde vorhergesagt, dass der Wirt zur Stickstofffixierung fähig ist, und der Erwerb des Plasmids geht mit einer erhöhten Ammoniakproduktion einher. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass neue experimentelle Strategien in Kombination mit bioinformatischen Analysen metagenomischer Daten Einblicke in das Nanobiom als Treiber der Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaft liefern können.

Der horizontale Gentransfer (HGT) kann das evolutionäre Schicksal von Mikroben deutlich beeinflussen [1,2,3]. Neben der Transformation – bei der Bakterien die DNA aus der Umgebung direkt aufnehmen – wird die gesamte horizontale Bewegung des genetischen Materials durch mobile genetische Elemente (MGEs) katalysiert, darwinistische Einheiten mit eigener Dynamik [4]. Im letzten Jahrhundert wurde eine Vielzahl von MGEs beobachtet, die von deutlich parasitären Bakteriophagen [5,6,7,8,9] und Transposons [10,11,12] bis hin zu Plasmiden [13,14,15] und integrativen Bakterien reichten und konjugative Elemente (ICEs) [16,17,18,19]. In jüngerer Zeit werden in der gesamten mikrobiellen Welt neue mobile Elemente entdeckt, wie etwa REPINs [20, 21], Raumschiffe [22] und Borgs [23], und sogar ganze Pilzchromosomen scheinen in Bewegung zu sein [24,25]. ,26].

Die Beziehungen zwischen MGEs und Hosts sind komplex, verändern sich ständig und sind stark kontextabhängig. Während beispielsweise konjugative Elemente typischerweise harmlos sind, können sie auch das Selbstüberleben auf Kosten des Wirts fördern [19, 27]. Auch wenn Bakteriophagen typischerweise räuberisch oder parasitär sind, können sie zum Nutzen des Wirts kooptiert werden [5, 28, 29, 30]. Darüber hinaus können MGEs miteinander rekombinieren oder andere mobile Elemente parasitieren [31,32,33,34,35]. Zusammengenommen könnten diese Prozesse für unser Verständnis von mikrobiellen Gemeinschaften als Ansammlungen lokal adaptiver Gene und nicht als lokal angepasste Arten von grundlegender Bedeutung sein (36, 37). Während der Umfang und das Ausmaß des DNA-Flusses durch mikrobielle Gemeinschaften über MGEs derzeit kaum verstanden sind, deuten neuere Arbeiten darauf hin, dass der Fluss möglicherweise sogar insofern von großer Bedeutung sein könnte, als er einen Prozess auf Gemeinschaftsebene definiert und antreibt, der ähnliche Auswirkungen wie das Geschlecht innerhalb von Populationen hat [ 38, 39].

Neben der Bewegung von Genen, die für die Selbstreplikation und Übertragung notwendig sind, vermitteln MGEs häufig auch die Übertragung von Wirtsgenen, mit denen sie verknüpft werden. Ob beabsichtigt oder zufällig, MGEs, die Gene erwerben, die die Fitness des Wirts verbessern, können durch Selektion schnell verstärkt werden, wobei eingefangene Gene weit verbreitet werden. Gelegentlich können die Auswirkungen äußerst folgenreich sein, beispielsweise wandelt die Bewegung von ICEs, die Gene für die Knötchenbildung und die Stickstofffixierung tragen, nicht-symbiotische Rhizobien in einem einzigen Schritt in pflanzliche Symbionten um [40, 41]. ICEs wurden auch durch Beobachtung der Bewegung antimikrobieller Resistenzen [42, 43] und Schwermetallresistenzgenen [18] identifiziert. Solche Entdeckungswege hängen jedoch sowohl von der Fähigkeit, fokale Mikroben zu kultivieren, als auch von der Übertragung selektierbarer phänotypischer Merkmale ab.

Mit zunehmender Fähigkeit, komplexe Gemeinschaften zu sequenzieren, wurde die Entdeckung von MGEs durch Metagenomik durch kulturunabhängige Zusammenstellung von DNA-Replikons vorangetrieben, ohne vorherige Annahmen über die biologische Relevanz. Darüber hinaus wurden bioinformatische Tools entwickelt, mit denen ein breites Spektrum möglicher MGEs von mikrobiellen Wirten getrennt werden kann [44,45,46,47,48,49,50,51]. Obwohl solche Tools die Differenzierung chromosomaler DNA von Phagen, Plasmiden und anderen MGEs ermöglichen, wird die Entdeckung von MGEs durch vorhandene Datenbanken und Trainingssätze, die auf bekannten MGEs basieren, eingeschränkt. Darüber hinaus liefert der metagenomische Nachweis von MGEs per se selten Aufschluss über die ökologische Relevanz des Elements. Die unvoreingenommene Erkennung und Charakterisierung unbekannter MGEs bleibt eine große Herausforderung.

Kürzlich haben Quistad et al. berichteten über eine allgemein anwendbare experimentelle Strategie, die die Bewegung von Genen über MGEs mit der Ökologie und Funktion komplexer mikrobieller Gemeinschaften verbindet [52]. Die Strategie nutzt die Tatsache aus, dass die langfristige Persistenz von MGEs – und insbesondere derjenigen, die für Hosts kostspielig sind – von der horizontalen Übertragung abhängt [53,54,55]. Wenn keine Möglichkeit besteht, auf neue Wirte zu treffen, verlieren MGEs ihre Replikationskapazität, was entweder zum Aussterben oder zur Kooptation als dauerhafte Bestandteile des Wirtsgenoms führt, zumindest in Fällen, in denen Elemente für den Wirt vorteilhafte Fitnesseffekte codieren. Der häufige Kontakt mit neuen Wirten kann MGEs stattdessen „evolutionäres Leben“ einhauchen und so die weitere Koevolution von MGEs und ihren Wirten vorantreiben [13, 14, 56].

In der Studie von Quistad et al. wurden Gartenkompostgemeinschaften in Glasmesokosmen angelegt und 48 Wochen lang aufrechterhalten. Diese Gemeinschaften wurden weiter in zwei Paare aufgeteilt: horizontale und vertikale Gemeinschaften. Bei vertikalen Gemeinschaften (im Folgenden: V-Gemeinschaften) wird eine Stichprobe der Gemeinschaft (einschließlich MGEs) regelmäßig in einen neuen Mesokosmos übertragen. Horizontale Gemeinschaften (im Folgenden: H-Gemeinschaften) werden ähnlich behandelt, jedoch mit einem wichtigen Unterschied: Zum Zeitpunkt der Übertragung wird eine Probe aller unabhängigen H-Gemeinschaften durch einen 0,2-µm-Filter geleitet und das Filtrat gesammelt. Die Filtration entfernt Bakterien und größere Einheiten, ermöglicht jedoch die Sammlung von Material mit einer Größe von weniger als 0,2 µm, zu dem bekannte MGEs wie Phagen, aber auch noch zu entdeckende Elemente und zusätzlich nackte DNA, Mineralien, Nährstoffe usw. gehören. Dieses Filtrat wird als „MGE-Cocktail“ bezeichnet. Der kombinierte MGE-Cocktail aller unabhängigen Gemeinschaften wird dann auf alle H-Gemeinschaften umverteilt (siehe Abb. 1a). Entwickelte Gemeinschaften wurden dann einer metagenomischen Sequenzierung unterzogen, die – aufgrund des experimentellen Designs – die Identifizierung von Sequenzen in den H-Gemeinschaften ermöglichte, die in den jeweiligen Vorfahrengemeinschaften nicht nachgewiesen wurden (im Folgenden als „einzigartige Sequenzen“ bezeichnet). Während ihre anfängliche Erkennung nicht von Übereinstimmungen mit bestehenden Virusdatenbanken abhing, konnte gezeigt werden, dass viele dieser einzigartigen Sequenzen tatsächlich phagenverwandte Proteine ​​kodieren. Im Prinzip könnte jedoch jedes Element im MGE-Cocktail mit der Fähigkeit, sich nach Einführung in eine neue horizontale Gemeinschaft zu verstärken, mit diesem experimentellen Design nachgewiesen werden.

Überblick über (a) den Versuchsaufbau, (b) Quellen einzigartiger Sequenzen und (c–e) die bioinformatische Pipeline. ein experimentelles Evolutionsprotokoll zur Identifizierung neuer MGEs und anderer mobiler Sequenzen [52]. Aus Gartenkompost wurden mehrere Parallelgemeinschaften gegründet, die dann auf Zellulose als einziger Kohlenstoffquelle vermehrt und alle zwei Wochen seriell übertragen wurden. Horizontale Behandlungen wurden mit einem „MGE-Cocktail“ versehen, der durch Zusammenführen von Material gewonnen wurde, das aus Proben gesammelt wurde, die durch 0,2-µm-Filter geleitet wurden. Durch diese Manipulation können MGEs und verknüpfte Gene horizontal von einer Gemeinschaft zur nächsten übertragen werden. b Die Sequenzierung von aus Mesokosmen gewonnenen Proben ergibt zwei Arten von „einzigartigen Sequenzen“. Gezeigt werden Cartoons, um zu veranschaulichen, wie einige einzigartige Sequenzen (links) das Ergebnis seltener Sequenzen sind, die bei früheren Stichproben nicht entdeckt wurden, während andere einzigartige Sequenzen (rechts) das Ergebnis einer echten Übertragung aus einer anderen Community sind. c Die erste Unterroutine von xenoseq (xenoseq_find) vergleicht rohe DNA-Sequenzen, die im Fastq-Format aus einer Probe (Abfrage, im Folgenden „evolved“ genannt) mit einer anderen Probe (Subjekt, im Folgenden „Vorfahren“ genannt) gelesen werden. Vorfahrenproben werden zu Contigs zusammengesetzt, die als Köder verwendet werden, um Lesevorgänge aus den weiterentwickelten Proben zu entfernen. Nicht kartierte Lesevorgänge aus den entwickelten Proben werden dann zu „einzigartigen Contigs“ zusammengesetzt, d. h. DNA-Abschnitten, die neu in der Community aufgetaucht sind. d Um zwischen zwei Quellen eindeutiger Sequenz zu unterscheiden, die in Panel b gezeigt werden, identifiziert die zweite Unterroutine (xenoseq_link) mögliche mobile Elemente, indem sie sie mit allen anderen Ahnengemeinschaften abgleicht. Die Teilmenge der Contigs, die allopatrischen Gemeinschaften zugeordnet werden, wird als xenotypische Contigs bezeichnet. e Schließlich werden die Verbreitungsmuster xenotypischer Contigs rekonstruiert, indem DNA-Sequenzen aus allen Gemeinschaften im Vergleich zu zusammengesetzten Contigs kartiert werden. Sequenzierungstiefe und -breite werden in einer tabellarischen Textdatei gespeichert.

Hier beschreiben wir eine breit anwendbare „xenoseq“-Pipeline (github.com/bramvandijk88/xenoseq), die als Eingabe rohe Sequenzierungslesungen aus Zeitreihenexperimenten verwendet und Sequenzen identifiziert, die aus allopatrischen Gemeinschaften übertragen und durch Replikation im Strom verstärkt wurden Gemeinschaft. Bei der Anwendung auf metagenomische Daten aus dem von Quistad et al. durchgeführten Experiment zeigen wir, dass Xenoseq problemlos MGE-Kandidaten erkennt, deren Dynamik (einschließlich der Herkunftsgemeinschaft) über die Zeit verfolgt werden kann. Ein wichtiges Merkmal von xenoseq ist die Fähigkeit, zwischen Sequenzen zu unterscheiden, die aufgrund demografischer Veränderungen in Mustern der Artenhäufigkeit ausgewählt werden, und solchen, die horizontal aus einer allopatrischen Gemeinschaft verbreitet werden. Letztere werden im Folgenden als „xenotypische Sequenzen“ bezeichnet. Wir zeigen, dass xenotypische Sequenzen mit erkennbaren Komponenten von Phagen und IS-Elementen, also kanonischen egoistischen genetischen Elementen (SGEs), angereichert sind. Weniger erwartet war die Beobachtung horizontal übertragener Nanobakterien und großer Plasmide. Um die Dynamik von MGEs im Laufe der einjährigen Studie zu untersuchen, wurden Metagenome-Assembled Genomes (MAGs) durch Kreuzassemblierung konstruiert, die Einblicke in die potenziellen Wirte dieser unerwarteten Elemente liefern und eine Verknüpfung mit der Verbreitung von MGEs ermöglichen die Veränderungen der Ammoniakproduktionsraten auf Gemeindeebene.

Die xenoseq-Pipeline (https://github.com/bramvandijk88/xenoseq, Abb. 1c–e) ist ein Wrapper, der Lesetrimmung, Assemblierung, Lesekartierung, Lesefilterung und lokale Ausrichtung kombiniert, um nach Beweisen für einen horizontalen Gentransfer oder ähnliches zu suchen Transfer anderer nanoskaliger Einheiten zwischen sich entwickelnden Gemeinschaften. Diese Pipeline verwendet als Eingabe rohe (ungekürzte) Fastq-Dateien, die Shotgun-Metagenomdaten abgeleiteter Proben (Abfrage, in der nach neu eingeführten Sequenzen gesucht werden soll) und Datensätze aus Vorfahrenproben (Referenz) enthalten. Abfragelesevorgänge werden mit fastp [57] (v0.23.2) gekürzt, mit BWA [58, 59] (v0.7.17) unter Verwendung von Standardoptionen den entsprechenden Referenz-Contigs zugeordnet und mit samtools [60] (v1.15.1) verwendet das Flag „−4“, um nicht zugeordnete Lesevorgänge zu extrahieren. Diese Lesevorgänge werden mit Megahit [61] (v1.2.9) zu „einzigartigen Contigs“ zusammengesetzt (xenoseq_find, Abb. 1c). Als nächstes werden diese einzigartigen Contigs mithilfe von NCBI Blast [62] (v.2.13.0) mit einer lokalen Datenbank aller anderen Referenzgemeinschaften abgeglichen, um die Entstehung einzigartiger Contigs mit allopatrischen „Spender“-Gemeinschaften zu verknüpfen. Verknüpfte Contigs werden mit Seqkit [63] (v.2.3.0) aus eindeutigen Contigs extrahiert (xenoseq_link, Abb. 1d). Standardmäßig werden Contigs mit einem Spender verknüpft, wenn die Explosion mindestens ein Segment mit hoher Bewertung und einer Mindestlänge von 300 mit einer Nukleotididentität von mindestens 99 % aufweist. Während der Algorithmus und die Grenzwerte die Empfindlichkeit über größere Evolutionsdistanzen begrenzen, sind sie darauf ausgelegt, Sequenzen zu erkennen, die kürzlich auseinander gegangen sind und immer noch weitgehend identisch sind. Die Contigs, die mit Zielsequenzen in allopatrischen Gemeinschaften übereinstimmen, werden als „xenotypische Contigs“ bezeichnet. Um schließlich Verschiebungen in der Häufigkeit der erkannten Contigs zu erkennen, werden Lesevorgänge aller Abfrage- und Referenzproben zugeordnet (xenoseq_trace) und Abdeckungs-/Breitenstatistiken werden in einer durch Tabulatoren getrennten Datei gespeichert. Dies ermöglicht die Visualisierung des Transfers zwischen Gemeinschaften (Abb. 1e). In diesem Manuskript analysieren wir weiter Sequenzen mit einer Länge von mehr als 10 kb.

Standardmäßig führt xenoseq alle Unterroutinen aus (xenoseq_find, xenoseq_link, xenoseq_trace), aber jede Unterroutine kann durch Ändern der Befehlszeilen-Flags unabhängig ausgeführt werden. Schließlich verwendet xenoseq GNU parallel59, um mehrere Jobs gleichzeitig auszuführen.

Zum Benchmarking der Pipeline wurde die Einführung von MGEs in Schein-Communitys simuliert (siehe ergänzendes Material I mit allen Einzelheiten). Sechs Bakteriengenomsequenzen wurden von RefSeq heruntergeladen. Anschließend wurden zwei Scheingemeinschaften generiert, eine mit einer gleichmäßigen Taxonverteilung (einfacher Datensatz) und eine mit einer stark verzerrten Taxonverteilung (harter Datensatz). Simulierte MGE-Sequenzen wurden entweder i) zufällig in Genomsequenzen eingefügt, die integrative Elemente darstellen, oder ii) als separate Replikons mit einem einzelnen Wirtsgenom verknüpft, indem sie der Genom-Fasta-Datei als separater Contig hinzugefügt wurden. Die Illumina-Sequenzierung wurde aus den resultierenden „Communitys“ mit ART62 simuliert, wobei sowohl Standard- als auch zehnfach erhöhte Fehlerraten verwendet wurden, die als Eingabe zum Benchmarking der Pipeline verwendet wurden. Die Simulation von Scheingemeinschaften und horizontalen Gentransferereignissen wurde in R v4.1.3 mit den Paketen biostrings60 v2.62.0 und seqinr61 v4.2.16 durchgeführt. Ein weiterer (kleiner) Mock-Community-Datensatz ist im Repository verfügbar und kann verwendet werden, um schnell zu testen, ob die Pipeline und ihre Abhängigkeiten korrekt konfiguriert sind.

Wir haben MAGs aus allen zwanzig Kompostgemeinschaften generiert. Durch die Kombination von Proben über mehrere Zeitpunkte hinweg haben wir die potenzielle Erkennung seltener Typen verbessert, deren Abdeckung in einer einzelnen Probe für die Zusammenstellung nicht ausreicht. Die Qualitätskontrolle der Sequenzierungslesevorgänge wurde mit Prinseq Version 0.20.4 [64] unter Verwendung von „–derep 14 -lc method -c Threshold 20“ durchgeführt. Wir haben Adapter mit Flexbar v.3.5.0 [65] mithilfe des Flags „–adapter-preset Nextera -ap ON“ gekürzt. Kombinierte Lesevorgänge von mehreren Zeitpunkten für jede Community wurden de novo unter Verwendung von metaSPades v.3.14.0 kreuzweise zusammengestellt [66]. Lesevorgänge aus jeder Probe wurden mit bwa-mem v.0.7.17-r1188 [59] wieder auf die zusammengestellten Contigs abgebildet, und Abdeckungsberechnungen wurden mit SAMtools v1.7 [60] durchgeführt. Contigs wurden mit metaBAT2 v2.12.1 [67] gruppiert und die MAG-Qualität wurde mit CheckM v1.1.3 bewertet [68]. Alle MAGs und Contigs wurden mit BAT und CAT (Bin/Contig Annotation Tool, Version 5.1.2) [69] annotiert, das Prodigal [70] zur Vorhersage offener Leserahmen und Diamond [71] zur Abfrage offener Leserahmen verwendet gegen die NR-Datenbank [72]. Wenn BAT oder CAT aufgrund widersprüchlicher Anmerkungen zwischen ORFs ein Taxon nicht zuverlässig zuordnen konnten, wurde dem MAG ein taxonomischer Rang höherer Ordnung zugewiesen: d. h. auf Gattungsebene, wenn die Artenidentität nicht zugeordnet werden konnte, und auf Familienebene, wenn die Gattung nicht zugeordnet werden konnte zugewiesen usw. CAT wurde mit den Parametern „--index_chunk 1 --block_size 5 --top 11“ unter Verwendung der am 30.04.2021 erstellten CAT-Datenbank und Taxonomie aufgerufen. Die Lesekartierung von Proben zu einzelnen Zeitpunkten (oben) wurde verwendet, um die relative Häufigkeit einzelner MAGs zu untersuchen. Das Nanobakterium MAG wurde in eine 16S-Phylogenie mit MAGs aus Grundwasserökosystemen von He et al. eingeordnet. [73] durch Extrahieren von 16S-Sequenzen mit Barnapp 0.9 und einem Neigbour-Joining-Baum wurde mit Geneious 2023.1.2 erstellt.

Um zu untersuchen, ob die identifizierten Sequenzen von lebenden Zellen oder von durch lysierte Zellen freigesetzter DNA stammen, haben wir die Fähigkeit mikrobieller Kompostgemeinschaften getestet, extrazelluläre DNA abzubauen. Zu diesem Zweck wurden vier experimentelle mikrobielle Gemeinschaften aus Proben von vier unabhängigen Komposthaufen etabliert. Der Kompost wurde in M9-Salzlösung gewaschen und mit Glycerinsalzlösung bei –80 ° C gelagert. Gefrorene Stammlösungen wurden auf Eis aufgetaut und 4,25 ml der Stammlösung wurden dann durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationszyklen (4000 g, 10 Min.) und Resuspension (in 5 ml steriler M9-Salzlösung) von Glycerin gewaschen, gefolgt von einer abschließenden Resuspension in 1 ml M9-Salzlösung. Die gewaschenen Zellen wurden dann in 100-ml-Flaschen mit 19 ml M9-Medium und einem Stück Zellulosepapier als Kohlenstoffquelle gegeben. Mesokosmen wurden ohne Schütteln 14 Tage lang bei 28 °C inkubiert, um das Wachstum der Gemeinschaft zu ermöglichen. Das gesamte Volumen einschließlich des restlichen Papiers wurde dann in 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, fünf Minuten lang gevortext, um eine Aufschlämmung zu erzeugen, und 1 ml der Aufschlämmung wurde für weitere 14 Tage Inkubation in frisches M9-Medium überführt. Während dieser Zeit wurde mit dem „DNeasy Ultraclean Microbial Kit“ (Qiagen) ein Vorrat an genomischer DNA (gDNA) aus Escherichia coli (REL606) hergestellt, was zu einem Vorrat von ~30 ml gDNA bei 20 µg/ml führte (gelagert bei –). 20 °C).

Die Gemeinschaften wurden dann ein zweites Mal auf vier replizierte Zellulose-Mesokosmen vermehrt, die mit gDNA versetzt waren. Es wurden auch gemeinschaftsfreie Mesokosmen etabliert, die als Kontrollen fungierten. Alle Mesokosmen wurden mit zehn µg E. coli-gDNA versetzt und nach 0, 1, 2 und 14 Tagen Inkubation destruktiv geerntet. Zur Probenahme wurde der Inhalt jedes Mesokosmos in ein 20-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, zu einer Aufschlämmung reduziert und dann 5 Minuten lang bei 4000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in sterile 15-ml-Röhrchen überführt und zur späteren DNA-Extraktion bei –80 °C eingefroren. Insgesamt wurden zu jedem Zeitpunkt vier Replikatgemeinschaften und drei gemeinschaftsfreie Kontrollen geerntet.

Um den relativen DNA-Abbau durch Gemeinschaften im Laufe der Zeit zu messen, wurden überstehende Proben auf Eis aufgetaut und weiter mit einem internen Standard von einem µg/ml gDNA von Pseudomonas fluorescens SBW25 versetzt. Anschließend wurden die Proben verwirbelt und mit einem 0,2-µm-Spritzenfilter filtriert. Die DNA von 2 ml versetztem Filtrat wurde unter Verwendung eines Phagen-DNA-Isolierungskits (Norgen Biotek Corp.) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert, mit der Ausnahme, dass zur Verbesserung der DNA-Ausbeute zwei (anstelle einer) ml-Probe durch eine einzelne Reinigungssäule geladen wurden. Die extrahierte DNA wurde dann mithilfe eines NextSeq MidOutput 300-Zykluslaufs sequenziert, was zu 2 × 150 bp Paired-End-Reads führte (siehe Ergänzungstabelle I). Die Lesevorgänge wurden mit Diamond54 mithilfe der Blastx-Subroutine an die nicht-redundante (NR)-Proteindatenbank [72] angepasst, wobei der oberste Treffer verwendet wurde, um den Lesevorgang entweder als P. fluorescens, E. coli oder „andere“ (die …) zu identifizieren Letztere repräsentieren entweder Arten, die in den Gemeinschaften vorkommen, oder fälschlicherweise zugewiesene Arten.

Virussequenzen wurden mit Vibrant (v1.2.0) [44], Virsorter2 (v2.2.3) [45], Seeker (v1.0.3) [46] und CheckV (v0.8.1) [74] vorhergesagt. Während CheckV in erster Linie darauf ausgelegt ist, die Vollständigkeit potenzieller Virusgenome abzuschätzen, haben wir festgestellt, dass Sequenzen mit entweder niedrigen, mittleren oder hohen Werten typischerweise auch von anderen Tools als viral identifiziert wurden (siehe Abb. 3 im Haupttext). Plasmidsequenzen wurden mit PlasFlow (v1.1.0)w [47] und PlasClass (v0.1) [48] und, falls relevant, dem Replikationsursprung mit OriFinder 2022 [75] vorhergesagt. ICEs wurden mit ICEfinder identifiziert [49]. IS-Elemente wurden mit ISEscan (v1.7.2.3) vorhergesagt [51]. Integrons wurden mit Integronfinder2 (v2.0rc6) vorhergesagt [50]. Alle offenen Leserahmen auf MGEs wurden mit Prokka (76) sowohl mit der Standarddatenbank als auch mit der PHROG-Datenbank (77) zur Identifizierung viraler Gene annotiert. Alle Tools wurden mit Standardoptionen ausgeführt. Die Ergebnisse sind in der Ergänzungstabelle 1, Blatt 3 aufgeführt.

Die limitierenden Ressourcen im M9-Medium des Experiments von Quistad et al. sind Kohlenstoff (bereitgestellt durch das Zellulosepapier) und Stickstoff (1 mM Ammoniumchlorid aus M9-Salzen), die beide alle 14 Tage während der seriellen Passage zugegeben werden. Um Einblick in die Gemeinschaftsfunktion zu erhalten, wurden MAGs auf das Vorhandensein von Genen untersucht, von denen vorhergesagt wurde, dass sie am Zelluloseabbau und Stickstoffstoffwechsel beteiligt sind. Obwohl viele relevante Proteine ​​beteiligt sind, konzentrieren wir uns auf Endoglucanasen und Cellobiosidasen (Celluloseabbau), Nitrogenasen (Stickstofffixierung) und Nitrat/Nitritreduktase (Stickstoffreduktion). „Privatere“ Funktionen wie die Fähigkeit zur Glukoseaufnahme, die Glykolyse und nachgeschaltete Stoffwechselwege werden in dieser Studie nicht berücksichtigt. Proteinsequenzen wurden aus der Uniprot-Datenbank extrahiert (Schlüsselwörter: „Endoglucanase“, „Cellobiosidase“, „Nitratreduktase“, „Nitritreduktase“ und „Nitrogenase“, alle mit der zusätzlichen Abfrage „reviewed:true“) und mit MAGs abgeglichen Diamond Blastx [71] mit Standardeinstellungen. Jedem MAG wurde eine Punktzahl zugewiesen, indem der Anteil der übereinstimmenden Abfragen berechnet wurde. Wenn beispielsweise eine von zwei Cellobiosidasen von Uniprot eine signifikante Übereinstimmung ergab, wurde eine Punktzahl von 0,5 vergeben. Alle Bewertungen sind in der Ergänzungstabelle 1, Blatt 5 angegeben. Für Abb. 5b wurde eine Stoffwechselfunktion zugewiesen, wenn die Bewertung größer als 0,1 war. Wenn zwei MAGs mit derselben CAT-Annotation in mehreren Gemeinschaften auftraten, die Stoffwechselwerte jedoch aufgrund von Unterschieden in der genomischen Abdeckung nicht identisch waren, wurde der höchste Wert verwendet.

Um die in DNA-Cocktails vorhandene DNA-Konzentration zu messen, wurden Kompost-Mesokosmen unter Verwendung des von Quistad et al. beschriebenen Protokolls erstellt. Kurz gesagt, im September 2021 wurden Proben aus einem Komposthaufen (Plön, Deutschland) entnommen. Fünf Gramm jeder Kompostprobe wurden in einen 100-ml-Glaskolben überführt, der ein 4 cm2 großes Stück Zellulosepapier als komplexe Kohlenstoffquelle (Whatman-Zellulosefilterpapier) enthielt ) in 20 ml minimalem M9-Medium, das 0,935 mM Ammoniumchlorid enthält. Anschließend wurden die Gründermesokosmen zwei Wochen lang ohne Schütteln bei 28 °C inkubiert. Die Deckel blieben leicht geöffnet, um einen Gasaustausch zu ermöglichen.

Nach einer zweiwöchigen Inkubationszeit wurde das Zellulosepapier in ein Falcon-Röhrchen mit 20 ml minimalem M9-Medium überführt und zu einer Aufschlämmung verwirbelt. Die Aufschlämmungen wurden verwirbelt und 12 ml Zelluloseaufschlämmung wurden 10 Minuten lang bei 4000 g zentrifugiert. Anschließend wurden 10 ml Überstand durch einen 0,2-µm-Filter filtriert, um den MGE-Cocktail herzustellen. Zur DNA-Extraktion wurden MGE-Cocktails unter Verwendung einer Ultrazentrifuge bei ~26.500 g für 45 Minuten konzentriert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 2 ml Medium resuspendiert. Die DNA wurde mit dem Phage DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp) oder dem QIAprep Spin Miniprep Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die Menge der extrahierten DNA wurde durch den Qubit HS-Assay bestimmt. Die Messungen sind in der Ergänzungstabelle I, Blatt 4 zu finden.

Die Datenanalyse und -visualisierung erfolgte in R [78] v4.1.3 unter Verwendung der Pakete ggplot2 [79, S. 2], dplyr [80] v1.0.9, ggplotly [81] v3.4.1, Patchwork [82] v1.1.1, gggenomes [83] v0.9.5.9000, ggraph (github.com/thomasp85/ggraph) v2.0.5 und rtracklayer [84] v1.60.0.

Es wurde eine bioinformatische Pipeline entwickelt, die neuartige MGEs und andere biologisch relevante Einheiten anhand metagenomischer Daten identifiziert. Die Pipeline stützt sich nicht auf vorhandene Datenbanken, sondern erkennt stattdessen die Übertragung von MGE-Kandidaten auf der Grundlage von Sequenzen, die neu in sich entwickelnden Communities eingeführt werden. Da solche Sequenzen „fremder“ Natur sind, bezeichnen wir sie als „xenotypische Sequenzen“: Die Pipeline wird als xenoseq bezeichnet (https://github.com/bramvandijk88/xenoseq). Eine vollständige Beschreibung der Bioinformatik-Pipeline finden Sie unter Methoden und Ergänzungsmaterial I und II.

Xenoseq wurde zunächst mit simulierten Scheingemeinschaften (Supplementary Materials II) einem Benchmarking unterzogen und dann auf Datensätze von Quistad et al. angewendet. Die Daten von Quistad et al. ist von besonderem Interesse, da das experimentelle Design die Verbreitung von MGEs innerhalb horizontaler Gemeinschaften ermöglicht, ohne dass mikrobielle Zellen wandern (Abb. 1a). Da aus allen Gemeinschaften zu verschiedenen Zeitpunkten kurzgelesene Metagenomproben hergestellt wurden, ist es möglich, Sequenzen zu identifizieren, die in den entwickelten Gemeinschaften nicht nativ sind, d. h. Kandidaten für den Transfer von Phagen, Plasmiden oder anderen MGEs. Allerdings sind nicht alle neu auftretenden Sequenzen auf den horizontalen Transfer des Nanobioms zwischen allopatrischen Gemeinschaften zurückzuführen. Falsch positive Ergebnisse können auftreten, wenn die Häufigkeit einer Sequenz innerhalb sympatrischer Gemeinschaften zunimmt, was bei seltenen Arten der Fall sein kann, die anfänglich unterhalb der metagenomischen Nachweisgrenze liegen (Abb. 1b). Dieses falsch positive Signal aufgrund des demografischen Wandels sollte gleichermaßen für horizontale und vertikale Gemeinschaften gelten. Nach der Identifizierung neu entstandener „einzigartiger Sequenzen“ (xenoseq_find, Abb. 1c) wird daher nach weiteren Beweisen für die Übertragung gesucht, indem diese Contigs mit Sequenzen aus allopatrischen Gemeinschaften abgeglichen werden (xenoseq_link, Abb. 1d). Beachten Sie, dass es immer noch zu falsch positiven Ergebnissen kommen kann, wenn Parallelgemeinschaften in ihrer Zusammensetzung sehr ähnlich sind. Im Quistad-Experiment sind die Gemeinschaften jedoch in ihrer Zusammensetzung unterschiedlich (siehe Lit. [52]). Als letzten Schritt liefert die Lesekartierung dann weitere Einblicke in die Entstehung und Verbreitung xenotypischer Contigs (siehe Abb. 1e).

Beachten Sie, dass Xenoseq grundsätzlich auf Datensätze angewendet werden kann, die von diesem speziellen Versuchsdesign abweichen. Während Quistad et al. Um Glasmesokosmen zu verwenden, würden Mäuse ebenfalls ausreichen, wenn man sich für die Entwicklung von Darmmikrobiomen interessiert. Das experimentelle Design könnte den Selektionsdruck aufdecken, dem solche natürlichen Gemeinschaften ausgesetzt sind, wobei die Bewegung von MGEs (und den Genen, die sie als Ladung transportieren) widerspiegelt, welche Merkmale für die Gemeinschaftsfunktion unter diesen Bedingungen relevant sind. Darüber hinaus könnte man sich entwickelnde Gemeinschaften einem besonderen Selektionsdruck aussetzen, z. B. im Hinblick auf antimikrobielle Resistenzen, um neue MGEs zu entdecken, die unter dieser Bedingung relevante Merkmale kodieren. Die einzige Voraussetzung besteht darin, dass Längsschnittproben aus Parallelgemeinschaften entnommen werden, in denen MGEs oder andere biologisch relevante Einheiten ausgetauscht werden.

Die Mesokosmen aus der Studie von Quistad et al. stellen aufgrund der beispiellosen Vielfalt und Fülle seltener Arten einen „herausfordernden Fall“ für die Xenoseq-Pipeline dar. Wie oben erwähnt, können Verschiebungen in der Häufigkeit seltener Arten (wie von Quistad et al. beobachtet) zu falsch positiven Ergebnissen führen (Abb. 1b). Zur Kontrolle haben wir Xenoseq daher auf vertikalen Gemeinschaften ausgeführt, die „geschlossen“ und von der Bewegung von MGEs aus allopatrischen Gemeinschaften nicht betroffen sind. Tatsächlich haben wir herausgefunden, dass einzigartige Sequenzen sowohl in horizontalen als auch in vertikalen Gemeinschaften vorhanden sind (Abb. 2a, insgesamt 5617 bzw. 6883 Sequenzen). Allerdings enthielten nur horizontale Gemeinschaften einzigartige Contigs, die mit allopatrischen Gemeinschaften verknüpft werden konnten (Abb. 2b). Insgesamt konnten 1756 (31,2 %) der Contigs in horizontalen Gemeinschaften mit einer allopatrischen „Spender“-Gemeinschaft verknüpft werden, im Vergleich zu nur 58 (0,8 %) der Contigs aus vertikalen Gemeinschaften. Die verbleibenden 58 Contigs könnten aufgrund von Überschneidungen zwischen den Kompostgemeinschaften der Vorfahren fälschlicherweise mit allopatrischen Gemeinschaften in Verbindung gebracht werden. Während alle abgeleiteten Kompostgemeinschaften Hinweise auf DNA-Sequenzen zeigten, die im Laufe der Zeit amplifiziert wurden, wurden Hinweise auf einen allopatrischen Ursprung dieser Sequenzen ausschließlich in horizontalen Gemeinschaften gefunden.

a Einzigartige Contigs innerhalb horizontaler (blau) und vertikaler (orange) Communities, identifiziert durch xenoseq_find. Die durchgezogenen Linien stellen den Mittelwert über 10 Gemeinden dar, die schattierten Bereiche stellen den Standardfehler dar. b Die Ausrichtung der von xenoseq_find identifizierten Contigs auf Vorfahrenproben ermöglicht die Verknüpfung von Donor-Akzeptor-Paaren (Beispielnetzwerk für horizontale und vertikale Gemeinschaften in Woche 40, siehe auch ergänzende Abbildungen 1+2). Bei horizontalen Communities stellen Links im Netzwerk Kandidatenelemente dar, die horizontal übertragen werden. Für vertikale Gemeinschaften stellen die Links stattdessen falsch positive Ergebnisse dar, da eine Übertragung aus allopatrischen Gemeinschaften durch das experimentelle Design ausgeschlossen ist. c Die Anzahl der in horizontalen Gemeinschaften identifizierten xenotypischen Contigs (Sequenzen, die mit mindestens einer Spendergemeinschaft verknüpft sind) wird in Blau angezeigt, und in vertikalen Gemeinschaften beobachtete falsch positive Ergebnisse werden in Orange angezeigt. Punkte stellen 10 verschiedene Replikatgemeinschaften dar, die zu jedem Zeitpunkt beprobt wurden, die durchgezogenen Linien stellen den Mittelwert über die Gemeinschaften dar und der schattierte Bereich stellt den Standardfehler dar.

Ein möglicher Störfaktor beim Nachweis xenotypischer Sequenzen entsteht, wenn die im MGE-Cocktail enthaltene nackte DNA während der 14-tägigen Inkubationszeit intakt bleibt und somit in den metagenomischen Daten landet. Um dies zu testen, fügten wir den Gemeinschaften exogene gDNA von Escherichia coli hinzu und überwachten deren Persistenz über die Zeit (siehe Methoden). In Gegenwart der mikrobiellen Gemeinschaften war E. coli-gDNA innerhalb von 48 Stunden nach der Zugabe nicht mehr nachweisbar (ergänzende Abbildung 3), während sie in gemeinschaftsfreien Kontrollen während des 14-tägigen Experiments nachweisbar blieb. Darüber hinaus halten wir es angesichts der DNA-Konzentrationen von 0,67 ng/ml in den anfänglichen MGE-Cocktails für höchst unwahrscheinlich, dass diese Sequenzen nach 14 Tagen einen signifikanten Beitrag zu den Community-Metagenomproben leisten würden. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass DNA-Sequenzen zunächst dem Abbau standhalten und dann innerhalb der Empfängergemeinschaft ausreichend verstärkt werden müssen, damit Xenoseq eine horizontale Übertragung vorhersagen kann. Eine solche Verstärkung weist auf eine Form der Selektion für den MGE-Kandidaten hin, z. B. weil es ein egoistisches Element ist oder einem Wirt einen erheblichen Fitnessvorteil vermittelt.

Der MGE-Cocktail, der zwischen Mesokosmen verteilt wurde, könnte Bakteriophagen, Plasmide, nackte DNA, Membranvesikel und potenzielle andere (unbekannte) Übertragungsvehikel enthalten. Die 1756 xenotypischen Sequenzen wurden mit verschiedenen MGE-Nachweistools abgefragt, die Vorhersagen darüber lieferten, ob die Sequenzen viral [44,45,46, 74], Plasmide45,46, IS-tragend49, ICE-tragend47 oder Integron-tragend48 sind . Wir fanden heraus, dass 714 (40,6 %) der xenotypischen Sequenzen von mindestens einem MGE-Vorhersagetool identifiziert wurden (siehe Abb. 3a). Es wurde eine erhebliche Überlappung zwischen Phagen und Plasmiden (Abb. 3b), aber auch zwischen anderen Elementen festgestellt. Diese Ergebnisse weisen auf die Existenz rekombinierter oder hybrider MGEs wie Phagenplasmide29 hin. Sie können auch Herausforderungen bei der eindeutigen Vorhersage des MGE-Typs aus der Sequenz mithilfe der ausgewählten Tools hervorheben.

a Zur Vorhersage von MGEs wurden verschiedene Werkzeuge verwendet, darunter Phagen, Plasmide, IS-Elemente, ICEs und Integrons in xenotypischen Sequenzen. Auf der x-Achse sind 714/1756 Kandidaten-MGE-Contigs mit mindestens einer MGE-Vorhersage aufgeführt. MGE-Werkzeuge sind auf der y-Achse dargestellt. Farbige Balken zeigen an, dass der Contig vom entsprechenden Tool vorhergesagt wurde. b Ein Venn-Diagramm zeigt erhebliche Überlappungen zwischen MGEs, insbesondere Phagen und Plasmiden. Dies kann auf Interaktionen oder Hybridisierungen von Phagen und Plasmiden hinweisen, könnte aber auch das Ergebnis einer fehlerhaften Zuordnung durch eines der Tools sein. c Die Anzahl der aus xenotypischen Sequenzen abgeleiteten MGE-Annotationen wird mit vier Kontrollen verglichen. Die Kontrollen bestehen aus Contigs mit ähnlicher Länge wie die xenotypischen Contigs, werden jedoch aus dem gesamten Metagenom der Kompostgemeinschaft entnommen. Ein modifizierter T-Test (Crawford-Howell [110]) wurde verwendet, um abzuleiten, ob Phagen, Plasmide, IS-Elemente, ICEs oder Integrons unter xenotypischen Sequenzen über- oder unterrepräsentiert waren (* = p-Wert < 0,05, ** = p-Wert < 0,01, *** = p-Wert < 0,001). Die genauen p-Werte, einschließlich derjenigen, die für mehrere Tests mithilfe einer Bonferroni-Anpassung korrigiert wurden, finden Sie in der Ergänzungstabelle 1, Blatt 3.

Um zu testen, ob xenotypische Sequenzen in MGEs angereichert sind, wurden diese Daten mit einem willkürlichen Satz von Sequenzen mit einer ähnlichen Längenverteilung verglichen, die aus den metagenomischen Contigs entnommen wurden. Beachten Sie, dass diese Community-Proben voraussichtlich immer noch viele MGEs enthalten, jedoch möglicherweise weniger als die xenotypischen Sequenzen. Tatsächlich scheinen Phagen und IS-Elemente unter den xenotypischen Sequenzen überrepräsentiert zu sein, wohingegen die Anzahl der Plasmide, ICEs und Integrons nicht signifikant unterschiedlich ist (Abb. 3c). Bei Korrektur mehrerer Tests blieben Phagen deutlich überrepräsentiert, dies galt jedoch nicht für IS-Elemente (siehe Ergänzungstabelle I, Blatt 3 für alle p-Werte). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse, da kanonisch egoistische Elemente angereichert zu sein scheinen, die Bedeutung der Sequenzverstärkung nach der Einführung in eine neue Gemeinschaft weiter untermauern.

Interessanterweise blieben nach der Anwendung von neun hochmodernen Tools zur Vorhersage von fünf Kategorien von MGEs 1042 xenotypische Contigs (59,4 %) unidentifiziert.

Um die Verbreitung und Dynamik xenotypischer Contigs zu untersuchen, wurde xenoseq verwendet, um Lesevorgänge aus allen Communities den xenotypischen Contigs zuzuordnen, die Kandidaten-MGEs darstellen. Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse für sieben ausgewählte Beispiele: einen vollständigen 200-kb-Phagen (Abb. 4a), eine unvollständige, aber reichlich vorhandene Phagensequenz (Abb. 4b), eine mutmaßliche virale Sequenz, die ausschließlich von Seeker vorhergesagt wurde (Abb. 4c), ein vorhergesagtes Element sowohl als Phagen als auch als Plasmid (Abb. 4d), ein großes 313-kb-Plasmid (Abb. 4e) und ein Abschnitt scheinbarer chromosomaler DNA neben einem IS3-Element (Abb. 4f).

Ergebnisse von xenoseq_trace für sieben xenotypische Sequenzen; aa Phagen mit 100 % Leseabdeckung, wie von CheckV gemeldet (abgekürzt als compl), b eine unvollständige, aber sehr häufig vorkommende Phagensequenz (zu bestimmten Zeitpunkten mit >106 Lesevorgängen abgedeckt), ca. mutmaßliche Virussequenz, die ausschließlich vom Sucher vorhergesagt wurde, da-Sequenz, an die berichtet wurde von allen relevanten MGE-Tools sowohl Phagen als auch Plasmid sein, ein großes Plasmid, das sich erfolgreich in vier Gemeinschaften etabliert, eine mutmaßliche chromosomale Region, die von einem transponierbaren Element flankiert wird, und eine Ga-Sequenz, von der nicht vorhergesagt wurde, dass sie ein MGE ist, die aber von CAT als Candidatus Saccharibacterium annotiert wurde. Für alle Panels werden die Häufigkeiten (y-Achsen, durchschnittliche Leseabdeckung) in allen Gemeinden über alle Zeitpunkte (x-Achsen) angezeigt. Die Abundanz in horizontalen Gemeinschaften wird in Blau angezeigt, während die Abundanz in vertikalen Gemeinschaften auf den gegenüberliegenden Achsen in Orange dargestellt wird. Gemeinschaften, deren Reihenfolge für das horizontale Regime einzigartig ist, sind fett dargestellt. Gemeinden, in denen der Contig nicht beobachtet wurde, werden der Übersichtlichkeit halber weggelassen. Der vollständige interaktive Datensatz ist als Zusatzmaterial verfügbar.

Xenoseq deckte auch die Übertragung von chromosomalen bakteriellen DNA-Fragmenten auf, für die keine MGE-Vorhersagen vorlagen. Viele davon wurden als Candidatus Saccharibacterium (Abb. 4g) bezeichnet, ein Mitglied der Kandidaten-Phylum-Strahlungsbakterien (CPR), die erstmals in menschlichen Mundhöhlen beobachtet wurden [85]. Obwohl dieses Nanobakterium tatsächlich klein genug sein könnte, um den 0,2-µm-Filter zu passieren, kommen Mitglieder dieser Art sowohl in horizontalen Gemeinschaften (Gemeinschaft 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9 und 10) als auch in vertikalen Gemeinschaften vor ( Gemeinschaft 1, 3, 4, 7, 8, 9, 10) mit unterschiedlichen Schätzungen der Genomvervollständigung (siehe Ergänzungstabelle 1). Das beste repräsentative MAG dieser Art wurde in HC10 beobachtet, das über ein kleines Genom (818 kb) verfügt, das dennoch auf 97 % vollständig geschätzt wurde und tatsächlich viele der relevanten Haushaltsgene (z. B. gyrA, recA, polA, topA, rpoB und ein einzelnes 16S-ribosomales RNA-Gen). Ein Vergleich der 16S-Sequenzen mit denen von kürzlich veröffentlichten CPR-Bakterien und DPANN-Archaeen aus Grundwasserproben (73) zeigt, dass sie sich zusammen mit anderen CPR-Bakterien ansammeln, die als Candidatus Saccharibacterium bezeichnet werden (siehe ergänzende Abbildung 4). Interessanterweise ergaben ausrichtungsfreie Schätzungen der durchschnittlichen Nukleotididentität (fastANI v1.33), dass die (nahezu vollständigen) nanobakteriellen MAGs aus den Gemeinschaften sehr ähnlich sind (bis zu 99,4 % ANI). Allerdings lieferte fastANI in Bezug auf die Grundwasser-CPR-Bakterien keine Ergebnisse, was dann der Fall ist, wenn die verglichenen Genome zu unterschiedlich sind. Zusammengenommen deuten diese Analysen darauf hin, dass die Nanobakterien in unseren Kompost-Mesokosmen eng mit diesen zuvor veröffentlichten bakteriellen MAGs verwandt sind, sich jedoch von ihnen unterscheiden.

Die Analyse des gleichzeitigen Vorkommens (siehe ergänzende Abbildung 5a) zeigt außerdem einen möglichen Zusammenhang zwischen dem identifizierten Nanobakterium und der Gattung Cellvibrio. Die Verfolgung der Häufigkeit beider Spieler im Zeitverlauf deutet auf eine potenzielle Boom-and-Bust-Dynamik hin, die durch lange Staseperioden unterbrochen wird (ergänzende Abbildung 5b). Eine solche Dynamik kann auf einen pathogenen Lebensstil hinweisen.

Bisher haben wir gezeigt, dass die Behandlung sich entwickelnder mikrobieller Gemeinschaften mit einem „MGE-Cocktail“, der aus allen Gemeinschaften stammt, die Bewegung verschiedener MGEs und sogar Nanobakterien zwischen Gemeinschaften fördert. Wir haben auch gezeigt, dass xenotypische Contigs besonders reich an SGEs sind, was die Bedeutung einer unabhängigen Sequenzamplifikation für das Überleben von MGEs nach der Einführung in allopatrische Gemeinschaften nahelegt. In den folgenden Abschnitten untersuchen wir die ökologischen und evolutionären Konsequenzen dieser Behandlung. Um zu untersuchen, ob und wie sich die horizontalen Gemeinschaften von den vertikalen Gemeinschaften unterscheiden, haben wir die Häufigkeit von MAGs untersucht. Diesen MAGs wurde mithilfe des Bin Annotation Tool (BAT) eine taxonomische Klassifizierung zugewiesen. Wenn der taxonomische Rang aufgrund widersprüchlicher ORFs nicht zuverlässig bestimmt werden konnte, wurde stattdessen ein taxonomischer Rang höherer Ordnung zugewiesen, um sicherzustellen, dass alle MAGs eine robuste Klassifizierung hatten.

Jedes MAG wurde auf verschiedene Gene untersucht, die mit zwei metabolisch relevanten Funktionen zusammenhängen: Zelluloseabbau und Stickstoffstoffwechsel (siehe Methoden und Ergänzungstabelle I, Blatt 5). Die relative Häufigkeit dominanter MAGs ist für jede Community in Abb. 5a dargestellt (eine interaktive Grafik aller MAGs finden Sie in den Zusatzdateien). Die MAGs werden entweder von Rhodanobacter- (in Abb. 5a braun dargestellt) oder Cellvibrio-Linien (grün dargestellt) dominiert. Mitglieder beider Gattungen sind in der Lage, Zellulose, die einzige Kohlenstoffquelle in den Mesokosmen, abzubauen (Abb. 5b). Da viele andere MAGs diese Fähigkeit nicht besitzen, scheinen Rhodanobacter und Cellvibrio eine ähnliche Nische zu besetzen und sind die Hauptabbauer von Zellulose, was erklären könnte, warum sie sich scheinbar gegenseitig ausschließen. Die beiden Gemeinschaftstypen haben außerdem unterschiedliche Abstammungslinien, die gemeinsam in den Mesokosmen leben. Beispielsweise koexistieren die von Rhodanobacter-Linien dominierten Gemeinschaften häufig mit Nitrosomonas europaeae (Stahlblau), das Nitrat und Nitrit reduzieren kann (Abb. 5b). Von Cellvibrio dominierte Gemeinschaften beherbergen stattdessen häufig Arten der oben genannten C. Saccharibakterien (gekennzeichnet durch ein Sternchen in Abb. 5a, b).

a Für alle 20 Wiederholungsexperimente (10 horizontal, 20 vertikal) wird die Häufigkeit (relative Leseabdeckung) für MAGs im Zeitverlauf angezeigt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden nur MAGs angezeigt, die über mehrere Zeitpunkte hinweg sehr häufig vorkommen (was durchschnittlich 59,6 % der gesamten Community entspricht), und die Häufigkeit wird als Anteil der Lesevorgänge angegeben, die nur diesen bestimmten MAGs zugeordnet sind. Eine Teilmenge der MAGs ist mit einem Buchstaben (C1, R, N, Cp usw.) gekennzeichnet, der der Legende in (b) entspricht. b Stoffwechselfunktionen, die jedem MAG zugeordnet sind. MAGs, die mutmaßliche Endoglucanasen, Cellobiosidasen, Nitrogenasen (I und II) und Nitrat-/Nitritreduktase kodieren, wurden den Celluloseabbauern, Cellulosefängern, Stickstofffixierern, Nitratreduzierern bzw. Nitritreduzierern zugewiesen (siehe Methoden). Basierend auf der Anzahl signifikanter Treffer auf diese Proteinsequenzen wurde ein Score berechnet, und MAGs mit einem Score von mehr als 0,1 werden in der Heatmap farbig dargestellt. c Ein kreisförmiges, 313 kb großes mobiles Element (Cp), das in vier unabhängigen horizontalen Gemeinschaften entsteht. Das Element enthält sowohl plasmidähnliche als auch phagenähnliche Merkmale.

Wie aus Abb. 5a ersichtlich ist, sind vertikale Gemeinschaften (VCs, links) in der Zusammensetzung dominanter MAGs relativ stabil und etablieren sich entweder mit Cellvibrio oder Rhodanobacter als primären Celluloseabbauern. Horizontale Gemeinschaften (HCs) zeigen jedoch schnelle Veränderungen bei diesen primären Degradern. Beispielsweise etabliert sich HC2 zunächst mit Rhodanobacter (braun) als primärem Abbauer. Allerdings wird in Woche 4 bis 8 eine Cellvibrio-Linie (C1, grün) im Vergleich zu anderen MAGs dominanter. Schließlich tritt Rhodanobacter erneut als primärer Abbauer in Erscheinung. Umgekehrt bilden sich HC8 und HC9 zunächst als Cellvibrio-Gemeinschaften und zeigen nach 32/40 Wochen vorübergehend das Auftreten einer Rhodanobacter-Linie.

Während die oben erwähnten durch die MGE-Cocktails verursachten Störungen vorübergehender Natur sind, scheint Cellvibrio C1 in HC6 die in den letzten 32 Wochen etablierte Ökosystemstruktur vollständig umzustürzen, obwohl unklar ist, ob diese Störung vorübergehender Natur ist, da uns danach keine Messungen vorliegen 48 Wochen. Cellvibrio C1 entsteht auch unabhängig voneinander in drei anderen Mesokosmen (in HC9 in Woche 8 und HC4 und HC10 in Woche 32), und seine Entstehung wird immer von einem MAG begleitet, das nur ein einzelnes 313-kb-Contig enthält (in Abb. 5a in Lila dargestellt). fortan Cp genannt). Dieses Contig ist zirkulärer Natur und tatsächlich dasselbe plasmidartige Element, das zuvor von xenoseq identifiziert wurde (Abb. 4e). Das große mobile Element trägt Plasmid-Partitionierungsproteine ​​(z. B. ParB und ParM), die typischerweise mit Plasmiden mit niedriger Kopienzahl assoziiert sind (86, 87) (siehe Abb. 5c), was damit übereinstimmt, dass es zusammen mit Cellvibrio C1 in etwa 1 auftritt: 1 Verhältnis. Zusätzlich zu den Merkmalen, die großen Plasmiden ähneln, trägt Cp auch viele mit Phagen assoziierte ORFs, wie aus Übereinstimmungen mit der viralen PHROGs-Datenbank66 hervorgeht (z. B. Integrase und Endolysin). Schließlich trägt Cp eine mutmaßliche konjugative Region, die von ICEfinder identifiziert wurde. Da dieses Plasmid zu früheren Zeitpunkten nur in VC/HC8 vorhanden war, deutet dies auf diese Gemeinschaft als Spender hin. Wir gehen davon aus, dass Cp sich horizontal überträgt und es Cellvibrio C1 (dem mutmaßlichen Wirt) ermöglicht, die zuvor etablierte Ökosystemstruktur zu verdrängen.

Da Zellulose die einzige exogen bereitgestellte Kohlenstoffquelle in den Mesokosmen ist, ist die Fähigkeit zum Abbau von Zellulose in vielen MAGs nicht überraschend (siehe Abb. 5b). Während alle Cellvibrio-Linien die Fähigkeit besitzen, Cellulose abzubauen, ist ein bestimmtes Cellvibrio (C1) einzigartig, da es auch ein stickstofffixierendes Enzym (Flavoprotein, EC 1.19.6.1) trägt. Die Fähigkeit, Stickstoff zu fixieren, ist wahrscheinlich wichtig, da 1 mM Ammoniumchlorid aus dem M9-Medium, das alle 14 Tage hinzugefügt wird, die einzige Quelle für exogen zugeführten Stickstoff ist. Wir stellten die Hypothese auf, dass das Cp-Plasmid möglicherweise regulatorische Auswirkungen auf den C1-Wirtsstoffwechsel hat und möglicherweise die Stickstofffixierung begünstigt.

In der Studie von Quistad et al. wurde die Ammoniakproduktion am Ende des Experiments (T = 48 Wochen) gemessen. Durch Auftragen der Häufigkeit von Cellvibrio C1 gegen Daten zur Ammoniakproduktion wurde in horizontalen Gemeinschaften eine starke positive Korrelation beobachtet (Abb. 6a), in vertikalen Gemeinschaften jedoch viel weniger. Beachten Sie, dass C1 in den meisten horizontalen Gemeinschaften das Cp-Plasmid trägt, C1 in vertikalen Gemeinschaften jedoch nicht. Wir vermuten, dass dies darauf hindeutet, dass C1 möglicherweise für die Akkumulation von Ammoniak verantwortlich ist, jedoch nur in Gegenwart des Cp-Plasmids. Tatsächlich haben wir anhand der Steigung der linearen Regression herausgefunden, dass horizontale Gemeinschaften eine deutlich steilere Korrelation zwischen C1- und Ammoniakproduktionsraten aufweisen, insbesondere zu Beginn des Wachstumszyklus (Abb. 6b). Wenn man sich schließlich nur auf horizontale Gemeinschaften konzentrierte, in denen Cp fehlte (HC3 und HC7), wurde keine positive Korrelation beobachtet (ergänzende Abbildung 6). Diese Daten legen nahe, dass Cp die Fixierung von Stickstoff durch Cellvibrio C1 fördert.

a Die relative Häufigkeit von Cellvibrio C1 wurde anhand des Anteils der Messwerte aus der Probe in Woche 48 durch Kartierung gegen dieses MAG bestimmt, das dann gegen Ammoniakproduktionsmessungen von Quistad et al. aufgetragen wurde [52]. Cellvibrio C1 war in fünf vertikalen und sieben horizontalen Gemeinschaften vorhanden, was insgesamt 12 Häufigkeitswerte für Cellvibrio C1 ergab, aufgetragen auf der x-Achse. Für jeden dieser Werte wurden drei technische Wiederholungsmessungen von Ammoniak zu mehreren Zeitpunkten im 14-Tage-Zyklus durchgeführt. Die y-Achse zeigt die gemessenen Ammoniakkonzentrationen (NH3 + NH4). An die Datenpunkte wurde ein lineares Regressionsmodell angepasst. Für die Tage 0, 1 und 14 werden diese Anpassungen mit den entsprechenden p-Werten und R2-Werten angezeigt (siehe ergänzende Abbildung 6 für alle Tage). b Die Steigung der linearen Regression ist für alle Tage im unteren Bereich aufgetragen. Dies zeigt, dass horizontale Gemeinschaften durchweg eine steilere Steigung aufweisen, was darauf hindeutet, dass das große Cp-Plasmid die Stickstofffixierung durch das Cellvibiro C1 MAG fördert. Fehlerbalken geben die Standardabweichung der Steigung über drei technische Wiederholungen von Messungen der Ammoniakproduktion an. Die Sternchen geben signifikante Unterschiede (Student-T-Test) zwischen den horizontalen und vertikalen Communities zu diesem Zeitpunkt an (* = p-Wert < 0,05, ** = p-Wert < 0,01).

MGEs sind wichtige Determinanten der mikrobiellen Evolution mit weitreichenden Auswirkungen im Kontext von Gemeinschaften. So vielfältig Mikrobiome auch sind, das Nanobiom – die Gruppe darwinistischer Einheiten, die von mikrobiellen Wirten abhängig sind – ist wahrscheinlich noch vielfältiger. Wir haben eine bioinformatische Pipeline namens xenoseq entwickelt, um Licht auf das Nanobiom zu werfen, inspiriert von Experimenten von Quistad et al. Mithilfe zeitaufgelöster metagenomischer Daten kann xenoseq zwischen zwei Quellen neuartiger Sequenzen unterscheiden, (i) solchen, die aufgrund lokaler demografischer Veränderungen entstehen, und (ii) solchen, die die Folge der horizontalen Übertragung nanoskaliger Einheiten zwischen parallelen Gemeinschaften sind. Wir zeigen, dass die letztere Kategorie xenotypischer Sequenzen nach Einführung in allopatrische Gemeinschaften eine Amplifikation erfordert. Wir fanden heraus, dass xenotypische Sequenzen besonders reich an egoistischen genetischen Elementen (Phagen und IS-Elementen) waren. Während andere MGEs wie Plasmide und ICEs nicht angereichert wurden, fanden wir einige unerwartete Akteure, die horizontal über das Filtrat übertragen wurden, darunter ein 313-kb-Plasmid und ein CPR-Nanobakterium. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass die Pipeline ein breites Spektrum interessanter MGEs erfolgreich identifizieren kann, ohne dass Vorkenntnisse über deren Identität erforderlich sind.

Die experimentelle Strategie von Quistad et al. und unsere bioinformatische Pipeline kann auf jede mikrobielle Gemeinschaft angewendet werden und spezifischen Selektionszwängen Rechnung tragen, wie z. B. Antibiotikaresistenz [88, 89], Schwermetallresistenz [90] oder Bioremediationskapazität [91]. Darüber hinaus kann die Methode auch ohne offensichtlichen Selektionsdruck direkte Beweise für den Selektionsdruck liefern, dem Gemeinschaften ausgesetzt sind, indem horizontal übertragene Merkmale identifiziert werden. Quistad et al. beobachteten die Anreicherung von Stickstoffstoffwechselgenen in horizontalen Gemeinschaften, die wir in dieser Studie mit der Proliferation einer großen 313 kb großen plasmidähnlichen Sequenz in Verbindung bringen konnten. Angesichts seiner offensichtlichen indirekten Rolle bei der Stickstofffixierung nehmen wir an, dass die Verstärkung dieses Elements einen Fitnessvorteil mit sich bringt (Abb. 6). Der Mechanismus des horizontalen Transfers ist unbekannt, es ist jedoch unwahrscheinlich, dass er über nackte DNA erfolgt, was die Möglichkeit zur Folge hat, dass das Element in Membranvesikeln (MVs) verpackt ist [92,93,94,95], wie kürzlich bei Klebsiella pneumoniae gezeigt wurde [96]. ].

Neben der Bewegung von MGEs legt unsere Studie auch nahe, dass der Wettbewerb zwischen ökologisch relevanten Arten in horizontalen Gemeinschaften verstärkt wird. Dieser verstärkte Wettbewerb könnte auf die „Kill the Winner“-Dynamik zurückzuführen sein [97], bei der Phagen vorzugsweise die Häufigkeit etablierter mikrobieller Arten reduzieren und gleichzeitig ihr eigenes evolutionäres Schicksal verbessern, wodurch Nischenraum für Konkurrenten verfügbar wird. Eine ähnliche Dynamik wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie beobachtet, die zeigt, wie die Induktion von Prophagen die Bildung chitinabbauender Gemeinschaften erheblich beeinflussen kann [98]. Insbesondere könnten diese Häufigkeitsverschiebungen das Problem falsch positiver Ergebnisse verschärfen, wie wir in dieser Studie beobachtet haben. Insgesamt argumentieren wir, dass es wichtig ist, das Verständnis darüber zu verbessern, wie MGEs die Konkurrenz zwischen mikrobiellen Arten beeinflussen – beispielsweise in gesellschaftlich relevanten Systemen wie dem menschlichen Darm [99] oder pflanzlichen Rhizosphären [100, 101] – was uns darüber hinaus weiterhelfen könnte um in Zukunft bessere evolutionäre Vorhersagen zu treffen [102].

Ein unerwartetes Ergebnis unserer Studie war die offensichtliche Übertragung eines CPR-Nanobakteriums des Stammes Saccharibakterien. Tatsächlich sind nahe Verwandte dieses Organismus nicht viel größer als ein Phagen75, und das reduzierte Genom (~818 kb) weist auf eine symbiotische Beziehung mit einer anderen Art hin. Es wurde gezeigt, dass sich das Nanobakterium eng mit CPR-Bakterien zusammenlagert, die in Grundwasserökosystemen beobachtet werden [73], wo nachweislich viele ultrakleine Zellen an der Zelloberfläche größerer Bakterien haften. Ähnliche Muster wurden bei Vampirococcus lugossi beobachtet, von denen man ebenfalls annimmt, dass sie Epibionten sind, die sich an photosynthetische Bakterien anheften [103]. Wir schlagen jedoch vor, dass es sich bei dem Nanobakterium in unserer Studie nicht um Episymbionten, sondern um einen intrazellulären Parasiten handelt, da die in der ergänzenden Abbildung 5b gezeigte Boom-and-Bust-Dynamik, die durch unterbrochene und lange Staseperioden unterbrochen wird, an die Raubtierdynamik erinnert, wie sie für beobachtet wurde Bdellovibrio bacteriovorus. Unsere Analyse des gleichzeitigen Vorkommens (siehe ergänzende Abbildung 5a) ergab einen möglichen Zusammenhang mit einer Bakterienlinie der Gattung Cellvibrio. Die Identifizierung dieses Nanobakteriums und die neu aufgestellte Hypothese einer Wirt-Parasit-Beziehung unterstreichen die zusätzliche Stärke unseres Ansatzes. Interessanterweise können viele Cellvibrio-Arten isoliert und kultiviert werden, was den Weg für zukünftige Studien über das Nanobakterium und seine Wechselwirkungen mit dem Wirt ebnet.

Kürzlich wurde eine Reihe annotationsfreier Methoden zur Verfolgung von HGT in mikrobiellen Ökosystemen entwickelt, die beispielsweise auf der differenziellen Leseabdeckung (104), Assemblierungsgraphen (105, 106), der Zuordnung diskordanter Lesepaare (107) oder der Hi-C-Metagenomik basieren [88, 108, 109]. Im Vergleich zu unserem Ansatz liefern diese Methoden jedoch keine Einblicke in die Dynamik und funktionellen Konsequenzen der MGE-Übertragung und wie dieser DNA-Fluss mikrobielle Gemeinschaften prägt. Unsere Strategie kombiniert experimentelle Intervention, Metagenomik und bioinformatische Analyse, um Elemente zu entdecken, die als Nanopartikel übertragen und anschließend verstärkt werden können, ohne dass die Elemente selbst vorher bekannt sind. Mit anderen Worten: Mit unserer Methode wird es möglich, das Nanobiom frei von vorgefassten Vorstellungen über die Identität seiner Mitglieder zu befragen.

Während wir die Entdeckung neuartiger und interessanter biologischer Einheiten veranschaulichen, besteht auch ein erhebliches Potenzial für falsch positive und falsch negative Ergebnisse. Wie in dieser Studie teilweise angesprochen, machen es die metagenomischen Nachweisgrenzen äußerst schwierig, mit Sicherheit zu sagen, ob eine Sequenz von Vorfahren in einer Gemeinschaft vorhanden war oder ob sie von einer allopatrischen Gemeinschaft erworben wurde. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Behandlung von Gemeinschaften mit MGE-Cocktails indirekte Auswirkungen auf die Zusammensetzung der Gemeinschaft hat, was, wenn es dazu führt, dass seltene Arten häufiger vorkommen, dieses Problem weiter verschärfen würde. Während unsere Pipeline versucht, diese Probleme zu reduzieren, indem sie Sequenzen mit ihrer Herkunftsgemeinschaft verknüpft, geht diese Strategie mit falsch-negativen Ergebnissen einher, da echte horizontale Gentransferereignisse fälschlicherweise verworfen werden können. Während wir argumentieren, dass Fortschritte wie die Hi-C-Metagenomik dazu beitragen könnten, einige dieser Schwierigkeiten zu lindern, schlagen wir auch vor, dass zukünftige Studien das experimentelle Protokoll auf einfachere (synthetische) Gemeinschaften anwenden, um die Unterscheidung fremder DNA von seltenen Sequenzen zu erleichtern. Beachten Sie jedoch, dass eine solche Vereinfachung auch einen Nachteil mit sich bringt, da sie unsere Fähigkeit beeinträchtigt, die Prozesse zu untersuchen, die der Komplexität selbst innewohnen [38]. Wir argumentieren daher, dass es zur Vertiefung unseres Verständnisses komplexer Mikrobiome auch wichtig ist, die Komplexität – mit allen damit verbundenen potenziellen Lärmquellen – zu berücksichtigen und die einfachen Regeln zu identifizieren, die die ökoevolutionäre Dynamik mikrobieller Gemeinschaften steuern.

Unsere Arbeit bestätigt frühere Schlussfolgerungen, dass mikrobielle Ökosysteme stark durch den von MGEs erzeugten DNA-Fluss beeinflusst werden, auch wenn dieser Fluss anfänglich subtil ist. Daher argumentieren wir, dass das Verständnis des Nanobioms – des Zoos darwinistischer Einheiten, die viel kleiner als Bakterien sind – von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der mikrobiellen Ökologie ist und wie sich diese Systeme schließlich so vergrößern, dass sie sich auf ganze Ökosysteme auswirken.

Rohe Sequenzierungsdaten stammen von Quistad et al. und sind online öffentlich verfügbar (https://www.mg-rast.org/mgmain.html?mgpage=project&project=mgp18485). MAGs, interaktive Datensätze und R-Skripte zum Entwerfen der Mock-Communitys werden auf Zenodo veröffentlicht (https://doi.org/10.5281/zenodo.7589193). Weitere Datenanfragen können an [email protected] gesendet werden.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Eitan Yaffe für die fruchtbaren Gespräche während der Entwicklung der Pipeline. Wir danken außerdem David Rogers für seine Hilfe bei statistischen Methoden, für die Aufklärung möglicher Quellen von Sequenzierungsartefakten, die unsere Analyse stören könnten, und für allgemein sehr aufschlussreiche Diskussionen.

BvD, AF, PB und PBR danken dem Sonderforschungsbereich 1182 „Ursprung und Funktion von Metaorganismen“ der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Unterstützung (Fördernummer SFB1182, Projekt C4 an PBR). PBR dankt der Max-Planck-Gesellschaft für die großzügige Grundfinanzierung. BED wurde vom European Research Council (ERC) Consolidator Grant 865694: DiversiPHI, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie Deutschlands – EXC 2051 – Projekt-ID 390713860 und der Alexander von Humboldt-Stiftung im Rahmen von unterstützt eine vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderte Alexander von Humboldt-Professur. Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Abteilung für Mikrobielle Populationsbiologie, Max-Planck-Institut für Evolutionsbiologie, Plön, Deutschland

Bram van Dijk, Pauline Buffard, Andrew D. Farr, Franz Giersdorf und Paul B. Rainey

Theoretische Biologie und Bioinformatik, Fachbereich Biologie, Science for Life, Universität Utrecht, Utrecht, Niederlande

Bram van Dijk, Jeroen Meijer und Bas E. Dutilh

Institut für Biodiversität, Fakultät für Biowissenschaften, Exzellenzcluster Balance of the Microverse, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Deutschland

Bas E. Dutilh

Labor für Biophysik und Evolution, CBI, ESPCI Paris, Université PSL CNRS, Paris, Frankreich

Paul B. Rainey

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BvD entwarf und testete die Pipeline, kuratierte, analysierte und visualisierte die metagenomischen Daten, schrieb den Originalentwurf und war für die Überprüfung und Bearbeitung während der Überarbeitungen verantwortlich. PB hat die Pipeline während der gesamten Entwicklung getestet und einem Benchmarking unterzogen. ADF und FG führten zusätzliche Experimente durch, um die Stabilität der DNA in den Kompost-Mesokosmen zu testen. JM und BED führten eine Kreuzmontage von MAGs durch. PB steuerte Ideen und Konzepte bei und war an der Ausarbeitung des endgültigen Manuskripts beteiligt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und der Veröffentlichung zugestimmt und stimmen zu, für die Arbeit zur Verantwortung gezogen zu werden.

Korrespondenz mit Bram van Dijk oder Paul B. Rainey.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

van Dijk, B., Buffard, P., Farr, AD et al. Die Identifizierung und Verfolgung mobiler Elemente in sich entwickelnden Kompostgemeinschaften liefert Einblicke in das Nanobiom. ISME COMMUN. 3, 90 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00294-w

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Eingegangen: 17. Februar 2023

Überarbeitet: 02. August 2023

Angenommen: 08. August 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00294-w

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