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Jun 20, 2024

Die Aggregation von Pseudomonas aeruginosa und die Psl-Expression im Sputum sind mit einem Versagen der Antibiotika-Eradikation bei Kindern mit Mukoviszidose verbunden

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 21444 (2022) Diesen Artikel zitieren 1165 Zugriffe 3 Zitate 2 Altmetrische Metrikdetails Wir haben zuvor gezeigt, dass P. aeruginosa-Isolate bestehen blieben

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21444 (2022) Diesen Artikel zitieren

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3 Zitate

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Wir haben zuvor gezeigt, dass P. aeruginosa-Isolate, die trotz inhalierter Tobramycin-Behandlung bei Kindern mit Mukoviszidose (CF) persistierten, in vitro eine erhöhte Bindung von Anti-Psl-Antikörpern aufwiesen im Vergleich zu erfolgreich ausgerotteten Isolaten. Unser Ziel war es, diese Ergebnisse durch die direkte Visualisierung von P. aeruginosa im CF-Sputum zu validieren. Hierbei handelte es sich um eine prospektive Beobachtungsstudie an Kindern mit CF und neu aufgetretener P. aeruginosa-Infektion, die sich einer inhalativen Tobramycin-Eradikationsbehandlung unterzogen hatten. Mithilfe der mikrobiellen Identifikations- und passiven Klarheitstechnik (MiPACT) wurde P. aeruginosa in vor der Behandlung entnommenen Sputumproben sichtbar gemacht und basierend auf den Ergebnissen als persistierend oder ausgerottet eingestuft. Isolate vor der Behandlung wurden auch in vitro als Biofilme gezüchtet. Von den 11 eingeschlossenen Patienten entwickelten 4 eine persistierende Infektion und 7 eliminierten die Infektion. Das Biovolumen von P. aeruginosa sowie die Anzahl und Größe der P. aeruginosa-Aggregate waren im Sputum der Patienten mit persistierenden Infektionen größer als bei denjenigen mit ausgerotteten Infektionen (p < 0,01). Die Menge an Psl-Antikörperbindung im Sputum war in Proben mit erhöhtem P. aeruginosa-Biovolumen insgesamt auch größer (p < 0,05). Bei der Visualisierung im Sputum hatte P. aeruginosa ein größeres Biovolumen mit stärker exprimiertem Psl und bildete bei CF-Kindern, bei denen die Eradikationstherapie versagte, zahlreichere, größere Aggregate im Vergleich zu denen, bei denen die Infektion erfolgreich beseitigt wurde.

Personen mit Mukoviszidose (CF) sind anfällig für eine Lungeninfektion mit Pseudomonas aeruginosa aufgrund von Defekten im Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR) für Mukoviszidose, die zu einer beeinträchtigten mukoziliären Clearance führen1. Ohne antimikrobielle Behandlung kann P. aeruginosa zu einer chronischen Infektion der Atemwege führen, die bei Patienten mit CF2,3 mit einem schnelleren Rückgang der Lungenfunktion und einem vorzeitigen Tod einhergeht. Eine frühzeitige antibiotische Eradikationsbehandlung (AET) der anfänglichen P. aeruginosa-Kolonisierung gehört daher zur klinischen Standardversorgung von Kindern mit CF, und die Erhöhung der Erfolgsrate der AET ist der Schlüssel zur Verbesserung der langfristigen Ergebnisse4,5.

Es gibt nur wenige Erklärungen dafür, warum die AET bei einem Patienten mit CF fehlschlagen kann. Wir haben zuvor mithilfe eines durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemachten Biofilmmodells gezeigt, dass die anfänglichen P. aeruginosa-Isolate von Kindern, bei denen die AET versagte, im Vergleich zu Isolaten von Kindern, bei denen P. aeruginosa geheilt wurde, eine signifikant erhöhte Bindung von Anti-Psl-Antikörpern aufwiesen6. Eine erhöhte Anti-Psl-Antikörperbindung war mit bakterieller Aggregation und Tobramycintoleranz verbunden. Psl ist ein P. aeruginosa-Exopolysaccharid (EPS), dessen Rolle bei der Zell-Zell- und Zell-Substrat-Anhaftung und der Biofilmbildung in vitro gut beschrieben ist7,8,9,10,11,12. Obwohl unsere Ergebnisse in separaten Sammlungen früher klinischer P. aeruginosa-Isolate aus zwei verschiedenen AET-Studien bestätigt wurden, basierten diese Ergebnisse auf In-vitro-Studien von P. aeruginosa in einem Glasobjektträgerkammersystem.

Trotz der Verwendung klinischer Isolate und bakterieller Wachstumsbedingungen, die die Atemwege von CF nachahmen, spiegeln laborbasierte Modelle, die das Verhalten von CF-Erregern und die Wirkung von Antibiotika untersuchen, die Bedingungen in den Atemwegen des Patienten möglicherweise nicht genau wider13. Entscheidungen über Inkubationszeiten, Wachstumsmedien und antimikrobielle Konzentrationen können beispielsweise die experimentellen Ergebnisse erheblich verändern und es ist sehr schwierig, die Komplexität der CF-Lungenumgebung vollständig zu erfassen. Angesichts dieser Herausforderungen ist es vielleicht nicht verwunderlich, dass es bei CF14 eine Diskrepanz zwischen den Ergebnissen der Antibiotika-Empfindlichkeitstests und den klinischen Ergebnissen gibt.

Jüngste Fortschritte bei der Verarbeitung und Bildgebung von Atemwegsproben haben jedoch die direkte Visualisierung und Interaktion mikrobieller Spezies in Patientenproben ermöglicht. Die von DePas et al. entwickelte Technik zur passiven Klarheit der mikrobiellen Identifizierung (MiPACT) fixiert und visualisiert Bakterien mithilfe der Hybridisierungskettenreaktion, um rRNA im CF-Sputum nachzuweisen15. Diese Methoden machen es überflüssig, Rückschlüsse bei der Übertragung von In-vitro- auf In-vivo-Ergebnisse zu ziehen. Ziel dieser Studie war die Validierung unserer früheren Ergebnisse einer erhöhten Anti-Psl-Antikörperbindung und Bakterienaggregation in persistierenden P. aeruginosa-Isolaten durch die direkte Visualisierung von P. aeruginosa-Biofilmen im Sputum in einer prospektiven Beobachtungsstudie mit Kindern mit CF, die sich einer AET unterziehen. Wir wollten außerdem feststellen, ob wir mithilfe unseres In-vitro-Biofilm-Objektträgerkammermodells tatsächlich In-situ-Ergebnisse aus klinischen Proben reproduzieren können.

Die Merkmale der eingeschlossenen Patienten sind in Tabelle 1 dargestellt. Insgesamt 11 CF-Patienten mit neu aufgetretener P. aeruginosa-Infektion produzierten vor Beginn der Behandlung eine Sputumprobe und wurden in die Studie einbezogen; 7 haben P. aeruginosa nach einem Monat inhaliertem Tobramycin erfolgreich ausgerottet (keine P. aeruginosa-positive Sputumkultur für mindestens 6 Monate nach der ersten positiven Kultur), während 4 trotz Therapie eine anhaltende Infektion entwickelten (P. aeruginosa-positive Sputumkultur in den 6 Monaten danach). die anfängliche positive Kultur) (siehe Methoden). Von den 4, die eine persistierende Infektion entwickelten, verfügten 3 über Follow-up-P. aeruginosa-Isolate, die für die Sequenzierung des gesamten Genoms verfügbar waren und die Persistenz desselben Stamms zeigten (weniger als 10 Einzelnukleotid-Polymorphismus-Unterschiede zwischen dem ursprünglichen und dem Follow-up-Stamm). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen in Bezug auf demografische Merkmale wie Alter, Geschlecht, Ausgangs-Lungenfunktion, Ernährungszustand oder Anteil der Patienten unter CFTR-Modulator-Therapie. Bemerkenswert ist, dass es keinen signifikanten Unterschied im Anteil der Patienten mit einem anfänglichen schleimigen P. aeruginosa-Isolat, die ausgerottet wurden, im Vergleich zu denen, die eine persistierende Infektion entwickelten, gab.

Von jedem eingeschlossenen Patienten wurde vor Beginn der Behandlung mit inhaliertem Tobramycin eine Sputumprobe entnommen und P. aeruginosa mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) markiert und mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Es gab ein erhöhtes P. aeruginosa-Biovolumen (pro Sputumstück) sowie eine erhöhte Anzahl größerer P. aeruginosa-Aggregate im Sputum von CF-Kindern, bei denen die Eradikationstherapie anschließend versagte, im Vergleich zu denen, die die Infektion erfolgreich überstanden hatten (Abb. 1). Repräsentative Bilder sind in Abb. 2 dargestellt. Die Menge an P. aeruginosa in jeder Sputumprobe wurde auch mithilfe der quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR) quantifiziert; Die durch qPCR gemessenen P. aeruginosa-Konzentrationen korrelierten nicht mit dem direkt in fixierten Sputumproben sichtbar gemachten P. aeruginosa-Biovolumen (ergänzende Abbildung 1). Ebenso gab es keine Korrelation zwischen dem Biovolumen von Sputum P. aeruginosa und semiquantitativen Messungen des Wachstums von P. aeruginosa beim Ausplattieren der ursprünglichen Sputumprobe im Labor für klinische Mikrobiologie (Daten nicht gezeigt).

Patienten mit anhaltender Infektion hatten ein größeres P. aeruginosa-Biovolumen und eine größere Anzahl größerer Aggregate im Vergleich zu Patienten mit ausgerotteter Infektion. Visualisierung von P. aeruginosa in der ersten Sputumprobe von Negativkontrollen (Negative PA, n = 3), Positivkontrollen (Chronische PA, n = 3), CF-Kindern, bei denen die Infektion ausgerottet wurde (Eradiziert, n = 7) und CF-Kindern, die eine persistierende Infektion entwickelten (Persistent, n = 4). Dargestellter Median (horizontale Linie) P. aeruginosa (A) durchschnittliche Biovolumenintensität (µm3)/Sputumscheibe, (B) durchschnittliche Anzahl von Aggregaten/Sputumscheibe, (C) durchschnittliche maximale Aggregatgröße (µm)/Sputumscheibe. **p < 0,01 mit Mann-Whitney-Test.

Repräsentative konfokale 3D-Bilder von P. aeruginosa im Sputum von CF-Patienten, die bei Patienten mit persistierender Infektion zahlreichere, größere Aggregate zeigen als bei Patienten mit ausgerotteter Infektion. Die strukturellen Unterschiede von P. aeruginosa werden mithilfe einer fluoreszierend markierten molekularen Sonde, die für P. aeruginosa spezifisch ist (grün), Anti-Psl-mAb (magenta), molekularen Sonden mit DAPI-Nukleinsäurefärbung (blau) und einem zusammengeführten Bild mit einer 100-fachen Ölobjektivlinse dargestellt .

Pseudomonas aeruginosa Psl wurde auch im Sputum mithilfe eines fluoreszierend markierten Anti-Psl-Antikörpers sichtbar gemacht. Abbildung 3A zeigt, dass die Menge der Psl-Antikörperbindung im Sputum bei denjenigen, die eine anhaltende Infektion entwickelten, größer war als bei denjenigen, die die Infektion ausgerottet hatten. Allerdings war die Bindung von Psl-Antikörpern pro 100.000 µm3 P. aeruginosa-Biovolumen nach Korrektur des erhöhten P. aeruginosa-Biovolumens in der ausgerotteten Gruppe etwas höher als in der persistierenden Gruppe (p = 0,04, Abb. 3B). Der Anteil des mit P. aeruginosa kolokalisierten Anti-Psl-Antikörpers (dargestellt durch den M2-Koeffizienten) war sowohl in der ausgerotteten als auch in der persistierenden Gruppe ähnlich (Abb. 3C). Abbildung 3D zeigt repräsentative Bilder jeder Kategorie von Sputumproben.

Insgesamt stärkere Anti-Psl-Antikörperfärbung von P. aeruginosa im Sputum von Patienten mit persistierender Infektion im Vergleich zu ausgerotteter Infektion. Erste Sputumprobe von Negativkontrollen (Negative PA, n = 3), Positivkontrollen (Chronische PA, n = 3), Kindern mit CF, bei denen die Infektion ausgerottet wurde (Eradiziert, n = 7) und Kindern mit CF, die eine persistierende Infektion entwickelten ( Persistent, n = 4). Die horizontale Linie gibt den Median an. (A) durchschnittliche Bindungsintensität von Anti-Psl-Antikörpern (µm3)/Sputumschnitt, (B) durchschnittliche Bindung von Psl-Antikörpern pro 100.000 µm3 P. aeruginosa-Biovolumen/Sputumschnitt, (C) durchschnittlicher Anteil von Anti-Psl-Antikörpern, die zusammen mit P. aeruginosa lokalisiert sind . aeruginosa dargestellt durch den M2-Koeffizienten, (D) repräsentative Bilder aus Sputum eines Patienten mit persistierender, ausgerotteter und chronischer Infektion, grün: P. aeruginosa, magenta: Anti-Psl-Antikörper, weiß: Psl-Antikörper, kolokalisiert mit P. aeruginosa . *p < 0,05, ns: nicht signifikant nach Mann-Whitney-Test.

Um festzustellen, ob diese bei Kindern mit CF beobachteten P. aeruginosa-Merkmale in vitro reproduziert werden können, haben wir dann die ersten von diesen Patienten erhaltenen P. aeruginosa-Isolate 48 Stunden lang als Biofilme in unserem Objektträgerkammermodell aus Glas gezüchtet. Wie bei P. aeruginosa im Sputum war die Psl-Antikörperbindung (pro Vertiefung) bei Isolaten von Kindern, die eine persistierende Infektion entwickelten, größer als bei Isolaten von Kindern, bei denen die Infektion ausgerottet wurde (Abb. 4A). Nach Korrektur des P. aeruginosa-Biovolumens unterschied sich die Psl-Antikörperbindung pro 100.000 µm3 P. aeruginosa-Biovolumen jedoch nicht zwischen persistierenden und ausgerotteten Isolaten (Abb. 4B). Obwohl das mittlere P. aeruginosa-Biovolumen in den Objektträgerkammern nach 48 Stunden Wachstum bei persistierenden Isolaten größer war als bei ausgerotteten Isolaten, war dieser Unterschied statistisch nicht signifikant (Abb. 4C).

Insgesamt stärkere Anti-Psl-Antikörperfärbung in der Glasobjektträgerkammer von P. aeruginosa-Isolaten von Patienten mit persistierender Infektion im Vergleich zu ausgerotteter Infektion. Ausgerottete (n = 7) und persistierende (n = 4) P. aeruginosa-Isolate wurden 48 Stunden lang als Biofilme in einer Objektträgerkammer aus Glas gezüchtet und dann 3 Stunden lang mit fluoreszierendem Anti-Psl-Antikörper markiert und anschließend mit konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Horizontale Linie, Median. (A) durchschnittliche Anti-Psl-Antikörperbindungsintensität (µm3)/Well, (B) durchschnittliche Psl-Antikörperbindung pro 100.000 µm3 P. aeruginosa Biovolumen/Well, (C) durchschnittliche P. aeruginosa Biovolumenintensität (µm3)/Well. *p < 0,05, ns: nicht signifikant nach Mann-Whitney-Test.

Da persistierende Isolate bei unseren Patienten durch die Tobramycin-Therapie nicht beseitigt werden konnten, wollten wir herausfinden, ob diese Tobramycin-Toleranz in unserem In-vitro-Modell gemessen werden kann. Ursprüngliche P. aeruginosa-Isolate von Patienten, die anschließend eine persistierende (persistente Isolate) oder ausgerottete Infektion (eradizierte Isolate) entwickelten, wurden 24 Stunden lang als Biofilme in Objektträgerkammern aus Glas gezüchtet und dann 24 Stunden lang hochdosiertem (1000 µg/ml) Tobramycin ausgesetzt . Tobramycin reduzierte das Biovolumen der ausgerotteten Isolate erheblich, nicht jedoch der persistenten Isolate (Abb. 5A). Um die CF-Lungenumgebung nachzubilden, wurden Isolate auch in Gegenwart von 5 % gepooltem CF-Sputumüberstand gezüchtet und dann mit Tobramycin behandelt; Auch hier war das Biovolumen der ausgerotteten Isolate deutlich reduziert und es gab einen nicht signifikanten Trend (p = 0,05) zu einer signifikanten Reduzierung der persistierenden Isolate (Abb. 5A). Die metabolische Aktivität der Isolate wurde ebenfalls mithilfe eines ATP-Assays gemessen und zeigte eine signifikante Verringerung durch die Behandlung mit Tobramycin bei ausgerotteten und persistierenden Isolaten unter beiden Wachstumsbedingungen (Abb. 5B). Der Grad der Bakterienaggregation (gemessen anhand des Verhältnisses von Oberfläche zu Biovolumen) unterschied sich bei ausgerotteten und persistierenden Isolaten nicht (Abb. 5C).

Unterschiede in der Tobramycin-Reaktion und Aggregation zwischen persistierenden und ausgerotteten P. aeruginosa-Isolaten in der Objektträgerkammer aus Glas. Ausgerottete (n = 7) und persistierende (n = 4) P. aeruginosa-Isolate wurden 24 Stunden lang als Biofilme in einer Objektträgerkammer aus Glas gezüchtet und dann weitere 24 Stunden lang mit 1000 µg/ml Tobramycin behandelt und dann mit konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. LB: Lysogeny Broth allein; + T: plus Tobramycin; SS: in Gegenwart von 5 % gepooltem CF-Sputumüberstand. Horizontale Linie, Median. (A) durchschnittliche P. aeruginosa-Biovolumenintensität (µm3)/Well, (B) durchschnittliche Lumineszenz in relativen Lichteinheiten (RLU) des ATP-Assays/Well, (C) durchschnittlicher Aggregationsgrad, gemessen anhand des Verhältnisses von Oberfläche zu Biovolumen/Well. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns: nicht signifikant unter Verwendung des Mann-Whitney-Tests.

Unseres Wissens ist diese Studie die erste, die zeigt, dass Kinder mit CF, denen es nicht gelingt, eine neu aufgetretene P. aeruginosa-Infektion mit einer Tobramycin-Therapie auszurotten, mit zahlreicheren, größeren Aggregaten von P. aeruginosa infiziert sind, die aufgrund des erhöhten Biovolumens einen erhöhten Psl exprimieren P. aeruginosa. In vitro wurde bei persistierenden Isolaten im Vergleich zu ausgerotteten Isolaten auch eine erhöhte Bindung von Anti-Psl-Antikörpern beobachtet, aber nach Korrektur des Biovolumens war dieser Unterschied nicht signifikant; Tobramycin-Resistenz und stärkere Bakterienaggregation wurden bei persistenten Isolaten in unserem Objektträgerkammermodell nicht durchgängig beobachtet, was die Bedeutung einer direkten In-vivo-Beobachtung von P. aeruginosa-Lungeninfektionen bei CF-Patienten unterstreicht.

Frühere Studien, einschließlich unserer, haben versucht, P. aeruginosa-Merkmale zu identifizieren, die mit dem Versagen der AET bei CF verbunden sind. Es wurde zuvor gezeigt, dass Phänotypen, die mit chronischen Infektionen einhergehen, wie z. B. Schleimhautstatus und faltige Phänotypen, die typisch für Biofilmproduzenten sind, einen schwachen Zusammenhang mit dem Versagen von AET16,17 haben. Überraschenderweise wurde eine erhöhte Menge an P. aeruginosa, gemessen beispielsweise anhand der Bakteriendichte im Sputum, nicht als Risikofaktor für das Scheitern einer Eradikationsbehandlung mit inhaliertem Tobramycin identifiziert. Messungen der Sputumbakteriendichte werden vom Labor für klinische Mikrobiologie nicht routinemäßig bei unerwartet auftretenden Infektionen durchgeführt und basieren, was noch wichtiger ist, auf dem Planktonwachstum homogenisierter, seriell verdünnter und plattierter Sputumproben. Das erhöhte Biovolumen von P. aeruginosa, das bei unseren Patienten festgestellt wurde, die später eine anhaltende Infektion entwickelten, wurde nur bei der direkten Visualisierung ihrer eingebetteten und fixierten Sputumproben festgestellt. Das Sputum-P.-aeruginosa-Biovolumen korrelierte weder mit semiquantitativen Wachstumsmessungen auf Platten noch mit den im Sputum mittels PCR gemessenen P.-aeruginosa-Konzentrationen.

Durch die direkte Visualisierung von P. aeruginosa im Sputum konnten wir auch zahlreichere, größere Aggregate bei denjenigen beobachten, bei denen die AET fehlschlug. Bakterienaggregation ist ein bekannter Mechanismus der Antibiotikatoleranz und Immunumgehung18. Es gibt viele Faktoren, die zur Aggregation von P. aeruginosa in den CF-Atemwegen beitragen. Zu den intrinsischen bakteriellen Eigenschaften gehört die Expression von Psl. Unsere Mitarbeiter haben zuvor gezeigt, dass P. aeruginosa-Aggregate im CF-Sputum Psl exprimieren und dass eine solche Aggregation wahrscheinlich über einen EPS-vermittelten Polymer-Brückenmechanismus erfolgt19. Wir stellten eine erhöhte Anti-Psl-Antikörperbindung sowohl in vivo (im Sputum des Patienten) als auch in vitro (Isolate, die im Glasobjektträger-Kammermodell kultiviert wurden) bei Patienten mit CF mit persistierender im Vergleich zu ausgerotteter Infektion fest. Im Gegensatz zu unserer vorherigen Veröffentlichung war dieser Unterschied jedoch nach Anpassung pro 100.000 µm3 P. aeruginosa-Biovolumen nicht mehr signifikant, was darauf hindeutet, dass persistente Isolate keine erhöhte Expression von Psl pro Zelle aufweisen, sondern dass jede einzelne Zelle mehr exprimierte die gleiche Menge an Psl, in persistenten im Vergleich zu ausgerotteten Isolaten6. Zusätzlich zu den spezifischen Eigenschaften von P. aeruginosa gibt es extrinsische Faktoren, Bedingungen in den CF-Atemwegen, die die Bakterienaggregation fördern. Beispielsweise haben Singh et al. zeigten, dass sezernierte neutrophile Elastase im Sputumüberstand P. aeruginosa-Flagellen spalten kann, wodurch die Motilität verringert und eine Aggregation ausgelöst wird20. Bemerkenswert ist, dass diese Aggregation trotz Mutationen in biofilmbezogenen Genen auftreten kann, was den Unterschied zwischen Aggregation und Biofilmbildung unterstreicht. Auch die Zusammensetzung des Sputums selbst kann die Aggregation beeinflussen, da gezeigt wurde, dass Mucin die Aggregation verstärkt, ebenso wie das Vorhandensein von Wirtspolymeren über einen Abbaumechanismus21,22. Trotz der In-vitro-Züchtung unserer persistenten Isolate in gepooltem CF-Sputumüberstand (bestehend aus ausgeschiedenen Zellprodukten, aber ohne Wirts- oder andere Bakterienzellen) konnten wir die erhöhte Aggregation, die im Sputum von Patienten beobachtet wurde, die eine persistierende Infektion entwickelten, nicht reproduzieren. In ähnlicher Weise führte die Exposition ausgerotteter und persistierender Isolate gegenüber Tobramycin zu einer Abnahme der Stoffwechselaktivität, was möglicherweise eine bakterielle Schutzreaktion darstellt23. Eine direkte Analyse der Zusammensetzung des Sputums unserer eingeschlossenen Patienten würde den Rahmen dieser Studie sprengen, zukünftige Untersuchungen in diesem Bereich sind jedoch erforderlich.

Diese Studie nutzte MiPACT, um Bakteriengemeinschaften in den Atemwegen direkt sichtbar zu machen24. Andere Forscher haben diese Methoden verwendet, um die Zusammensetzung von Atemwegsinfektionen bei Patienten mit CF, mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) und mit beatmungsassoziierter Pneumonie (VAP) zu beschreiben15,25. Die aktuelle Studie ist jedoch die erste, die MiPACT verwendet, um Unterschiede in den bakteriellen Eigenschaften zu identifizieren, die mit dem Ansprechen auf eine Antibiotikatherapie korrelieren. Dies ist für CF-Patienten von besonderer Bedeutung, da bisher kein Test entwickelt wurde, der die klinischen Ergebnisse einer Antibiotikabehandlung vorhersagen kann14. Die Komplexität der CF-Lungenumgebung mit ihren einzigartigen Wachstumsbedingungen, polymikrobiellen Wechselwirkungen und Herausforderungen bei der Arzneimittelabgabe lässt sich im Labor nur sehr schwer, wenn nicht gar unmöglich, nachbilden13. Selbst in unserem Glasobjektträgerkammermodell, das auf Biofilmwachstum basiert und Wirtsfaktoren in Form von CF-Sputumüberstand einbezieht, konnten wir in vitro keine Tobramycintoleranz und Bakterienaggregation durch persistente Isolate konsistent nachweisen. Unsere früheren In-vitro-Studien, die Tobramycintoleranz und stärkere Aggregation in persistierenden P. aeruginosa-Isolaten zeigten, gelang dies nur mit der Zugabe von Staphylococcus aureus-Filtrat, SpA oder Anti-Psl-Antikörpern, deren klinische Relevanz unklar ist6,26. Die Verwendung der MiPACT-Methodik zur Visualisierung anderer Bakterienarten und Wirtsimmunzellen sowie ihrer räumlichen Interaktion hat das Potenzial, unser Verständnis komplizierterer CF-Infektionen, wie beispielsweise solcher, die mit Lungenexazerbationen einhergehen, zu verbessern15,27.

Diese Studie unterliegt mehreren Einschränkungen. Die Patientenstichprobe war klein und umfasste nur ältere Patienten, die Sputum produzieren konnten, was die Generalisierbarkeit der Ergebnisse auf CF-Kinder mit neu aufgetretener P. aeruginosa-Infektion, die anhand von Rachenabstrichen nachgewiesen wurde, einschränkte. Darüber hinaus ist die Gewinnung von Sputumproben mit der Einführung der CFTR-Modulator-Therapie schwieriger geworden, was die Fähigkeit von CF-Patienten zum Auswurf verringert28. Trotz der geringen Anzahl der eingeschlossenen Patienten wurden jedoch statistisch signifikante Unterschiede in der Bildung von P. aeruginosa-Aggregaten im Sputum zwischen den Patientengruppen nachgewiesen. Aufgrund des geringeren Sputumvolumens von Kindern war außerdem nicht genügend Probe vorhanden, um Reihenverdünnungen zur Berechnung der Sputumbakteriendichte [in koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml] durchzuführen. Zum Vergleich standen jedoch halbquantitative Messungen der P. aeruginosa-Belastung zur Verfügung, die durch Ausplattieren der ursprünglichen Sputumprobe im Labor für klinische Mikrobiologie ermittelt wurden. Schließlich konzentrierte sich diese Studie nur auf die Merkmale von P. aeruginosa selbst, die mit dem Versagen der AET in Zusammenhang stehen, aber es gibt wahrscheinlich auch andere Faktoren, wie z. B. Interaktionen mit anderen Organismen und Wirtsreaktionen, die eine Rolle spielen26. Andere Forscher haben gezeigt, dass polymorphkernige Leukozyten aggressiv auf eine Biofilmmatrix reagieren, die sowohl aus Psl- als auch aus Alginat-Exopolysacchariden besteht, Reaktionen, die in unserer aktuellen Studie nicht berücksichtigt wurden29.

Zusammenfassend zeigte diese Studie, dass Kinder mit CF, denen es nicht gelang, die P. aeruginosa-Atemwegsinfektion mit inhaliertem Tobramycin auszurotten, mit Psl-exprimierendem P. aeruginosa infiziert wurden, das zahlreichere und größere Aggregate bildete als diejenigen, die ihre Infektion erfolgreich beseitigten. Diese Patientengruppen konnten mit Standard-In-vitro-Methoden nicht zuverlässig unterschieden werden, was die Notwendigkeit einer direkten Visualisierung von Infektionen in den Atemwegen unterstreicht, um die Antibiotikareaktion bei CF vorherzusagen.

Dabei handelte es sich um eine prospektive Beobachtungsstudie, die von März 2020 bis 2022 bei SickKids (Toronto, Kanada) durchgeführt wurde. Kinder mit CF wurden eingeschrieben, wenn sie eine neu aufgetretene P. aeruginosa-Infektion hatten, definiert als eine für P. aeruginosa positive Sputumkultur mit mindestens drei vorangegangenen negativen Kulturen in den vorangegangenen 12 Monaten16,30. Nach der Einschreibung wurde vor Beginn der 28-tägigen Inhalation von Tobramycin eine Sputumkultur entnommen. Gemäß dem AET-Protokoll von SickKids wurden weitere 28 Tage inhaliertes Tobramycin verordnet, wenn die Sputumkultur, die eine Woche nach dem Ende der Behandlung mit inhaliertem Tobramycin erhalten wurde, immer noch positiv für P. aeruginosa war; Wenn die Sputumkultur nach der zweiten Runde inhaliertem Tobramycin immer noch positiv auf P. aeruginosa war, wurde der Patient ins Krankenhaus eingeliefert und intravenöses Tobramycin und Ceftazidim für 2 Wochen verschrieben, gefolgt von weiteren 28 Tagen inhaliertem Tobramycin31.

Ein AET-Versagen wurde definiert als eine P. aeruginosa-positive Sputumkultur in den 6 Monaten nach der anfänglichen positiven Kultur; Alle eingeschlossenen Patienten hatten eine Nachbeobachtungszeit von mindestens 6 Monaten in der Studie. Wenn bei einem Patienten die AET nicht bestand, wurde das anfängliche P. aeruginosa-Isolat (das vor Beginn der inhalativen Tobramycin-Injektion gewonnen wurde) als persistierend definiert; andernfalls wurde das ursprüngliche Isolat als ausgerottet definiert.

Negative Sputumkontrollen, die laut qPCR negativ für P. aeruginosa waren, wurden von CF-Kindern einbezogen, bei denen noch nie P. aeruginosa in ihren Atemwegen gewachsen war. Positive Sputumkontrollen, die durch qPCR positiv auf P. aeruginosa waren, wurden von CF-Kindern mit chronischer P. aeruginosa-Infektion einbezogen32. Die DNA-Extraktion und die qPCR wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt30.

Die Sputumverarbeitung wurde mit einer angepassten MiPACT-Technik (Tissue Clearing) durchgeführt, die zuvor beschrieben wurde15,24. Kurz gesagt: Ausgehustete Sputumproben wurden von eingeschriebenen Patienten in einem sterilen Becher gesammelt und sofort bei 4 °C gelagert. Innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme wurden Sputumpfropfen (ungefähr 0,2 g) in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, mit 1× phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann in kleine Scheiben (ungefähr 5 mm Durchmesser) geschnitten. Einzelne Sputumscheiben wurden in separate Vertiefungen eines Nunc™ Lab-Tek™ Achtkammer-Deckglasobjektträgers (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON) gegeben, der aus einer 250-µl-Hydrogelmischung bestand. Die Sputum-Hydrogel-Mischung (in den Kammervertiefungen) wurde in einem BD GasPak™ EZ-Behälter (VWR, Mississauga, ON) mit einer anaeroben Packung versiegelt und dann 3 Stunden lang bei 37 °C polymerisieren gelassen. Nach der Polymerisation wurde die verfestigte Probe 3–5 Tage lang bei 37 °C in 8 % Natriumdodecylsulfat (SDS)-Lösung (eingestellt auf pH 8) geklärt. Nach der Clearance wurden die Sputumhydrogele mit 1× PBS gewaschen und bis zur Bildgebung in 0,01 % (Gew./Vol.) Natriumazidlösung bei 4 °C gelagert.

Um P. aeruginosa und das Exopolysaccharid Psl in den Sputumhydrogelen sichtbar zu machen, wurde eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik (FISH) durchgeführt, wie zuvor beschrieben24 mit geringfügigen Anpassungen. Kurz gesagt: Sputum-Hydrogele wurden in drei dünne Scheiben (ca. 1 mm Dicke pro Stück) geschnitten und dann zu 500 µL Hybridisierungspuffer mit 4 µL 100 µM PsearA-Alexa488 (grün) Sonde gegeben. Die PsearA-Sonde, die auf das 16S-rRNA-Genfragment von P. aeruginosa abzielt, konnte 18–24 Stunden lang bei 46 °C mit den Sputumhydrogelen inkubieren. Die Sputumhydrogele wurden in einem Waschpuffer gespült und dann 6 Stunden lang bei 48 °C in 1 ml frischem Waschpuffer inkubiert. Nach der DNA-Sonden-Hybridisierung wurden die Sputum-Hydrogele mit 1 × PBS gewaschen und 18–24 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur in 2 % Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Sputumhydrogele entnommen und zu 500 µL frischer 2 % BSA-Lösung mit 4 µL 2 mg/ml Psl0096-Alexa594 (rot) Anti-Psl-Antikörper gegeben und dann 6 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert . Die Sputumhydrogele wurden mit 1× PBS gewaschen und dann in 250 µL Brechungsindex-Anpassungslösung (RIMS) mit 4 µL 10 µg/ml DAPI im Dunkeln bei Raumtemperatur unter sanfter Rotation inkubiert. Die Sputum-Hydrogel-Scheiben wurden auf einen Objektträger montiert und mit einer 1,7 mm CoverWell™ Perfusionskammer (Sigma-Aldrich, Oakville, ON) versiegelt.

Die für die Analyse verwendeten Bilder wurden mit einem Quorum Wave FX Borealis Spinning Disk Confocal Microscope, basierend auf einem Yokohama CSU-10 Scankopf, aufgenommen. Fluoreszierend markierter (rot) Psl0096-Antikörper, PsearA P. aeruginosa (grün) Sonde und DAPI (blau) Nukleinsäurefärbung wurden mit 561, 491 bzw. 405 nm Anregungslinien angeregt. Die Sputumhydrogele wurden mit einer 20-fachen/0,75-Zeiss-Linse sichtbar gemacht, die an einen 1,6-fachen Vergrößerungskoppler gekoppelt war. Die Bildaufnahme wurde mit der Software Quorum Volocity 6.3 durchgeführt. Pro Objektträger wurden insgesamt 6 Z-Stapelbilder in Schritten von 0,3 µm aufgenommen. Die gesamte Bildverarbeitung von Hydrogel-Z-Stack-Bildern wurde mit Volocity durchgeführt. Die Kolonisierung von P. aeruginosa im Sputum wurde mithilfe der Biovolumenintensität, der maximalen Objektgröße (Mindestmessung als Aggregatsatz von 2 µm3) und der Populationszahlfunktionen quantifiziert. Die Psl-Antikörperbindung innerhalb von P. aeruginosa-Biofilmen wurde anhand des Gesamtvoxelverhältnisses des roten zum grünen Kanal berechnet. Zuletzt wurde der Manders-Koeffizient (M2) ausgewählt, um den Grad der Co-Lokalisierung von Psl zu PA zu berechnen. Alle Bilder sind in den ergänzenden Materialien als ergänzende Abbildung 2 enthalten.

Dreidimensionale repräsentative Bilder bei 100-facher Ölimmersion wurden mit einem konfokalen STED-Mikroskop Leica SP8 Lightning aufgenommen. Die Sonde PsearA P. aeruginosa (grün), der Antikörper Psl0096 (magenta) und die Nukleinsäurefärbung DAPI (blau) wurden mit Anregungslinien bei 592, 488 bzw. 405 nm angeregt. Die Sputumhydrogele wurden mit einer 100×/1,4 (STED) Öllinse sichtbar gemacht. Die Bilderfassung und -verarbeitung erfolgte mit der Software Leica LAS, Lightning Module und Navigator. Repräsentative Z-Stapelbilder ausgerotteter und persistierender P. aeruginosa-Isolate wurden in Schritten von 0,25 µm aufgenommen.

Ein Teil des von den Studienpatienten gesammelten Sputums wurde zur Gewinnung des P. aeruginosa-Isolats verwendet. Sputumproben wurden auf MacConkey-Agar (mit 8 % Kristallviolett) ausgestrichen und dann 48 Stunden lang bei 42 °C inkubiert. Anschließend wurden einzelne Morphotypen für weitere 24 Stunden bei 37 °C auf Blutagar gezüchtet. Die Identifizierung von P. aeruginosa wurde durch Matrix-unterstützte Desorption/Ionisations-Flugzeit (MALDI-ToF) bestätigt und die Isolate wurden bis zur anschließenden Untersuchung mittels Glasobjektträger-Kammermodell und ATP-Assay bei –80 °C eingefroren. Wenn das Isolat nicht aus der für MiPACT gewonnenen Sputumprobe gewonnen werden konnte, wurde für die folgenden Experimente das ursprüngliche P. aeruginosa-Isolat gewonnen, das vom Labor für klinische Mikrobiologie in der ersten Sputumprobe des Patienten identifiziert wurde.

Aus den Sputumproben gewonnene Pseudomonas aeruginosa-Isolate wurden als Biofilme unter Verwendung eines Nunc Lab-Tek II, 8-Kammer-Deckglasobjektträgers (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON), wie zuvor beschrieben, gezüchtet33. Kurz gesagt, P. aeruginosa wurde in LB (optimal für das Wachstum von Biofilmen in der Objektträgerkammer aus Glas) 24 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln (225 U/min) gezüchtet. Die Kultur wurde 1:100 verdünnt und dann bis zu einer frühen logarithmischen Phase von 0,1 OD bei 600 nm gezüchtet. Von dieser Kultur wurden 200 µL in die Vertiefungen einer Objektträgerkammer aus Glas gegeben und dann 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und entweder 200 µL LB allein oder LB mit Tobramycin (Endkonzentration 1000 µg/ml) in die dafür vorgesehenen Vertiefungen gegeben und dann 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Medien entfernt und 200 µl Syto-9™ Lebendzell-Fluoreszenzfarbstoff in LB in die Vertiefungen gegeben und dann 45 Minuten lang inkubiert. Die Vertiefungen wurden 2x mit LB gewaschen und LB wurde vor der Visualisierung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) wieder in die Vertiefungen gegeben. Dieses Verfahren wurde auch in Gegenwart von 5 % gepooltem CF-Sputumüberstand wiederholt, basierend auf einem modifizierten früheren Protokoll34,35; Der Sputumüberstand besteht aus ausgeschiedenen Zellprodukten, jedoch nicht aus Wirts- oder Bakterienzellen, da der Fluoreszenzfarbstoff Syto-9™ an lebende Zellen unspezifisch bindet. Dieses Verfahren wurde wiederholt, um für jedes P. aeruginosa-Isolat drei biologische Replikate zu erhalten.

Um die Psl-Antikörperbindung zu messen, wurde P. aeruginosa auf die gleiche Weise bis zu einer frühen logarithmischen Phase von 0,1 OD bei 600 nm gezüchtet, wovon 220 µL in die Vertiefungen eines 8-Kammer-Deckglasobjektträgers gegeben und 24 Stunden lang bei inkubiert wurden 37 °C. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und frisches LB wieder in die Vertiefungen gegeben und dann für weitere 24 Stunden inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und entweder 200 µL LB allein oder LB mit Psl0096-Alexa594 (rot) Anti-Psl-Antikörper36 (Endkonzentration 56 µg/ml) in die dafür vorgesehenen Vertiefungen gegeben und dann 90 Minuten bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Medien entfernt und 200 µL Syto-9™ in LB in die Vertiefungen gegeben und dann weitere 45 Minuten lang inkubiert. Die Vertiefungen wurden 2x mit LB vor CLSM in LB gewaschen.

Die Quantifizierung der Biovolumenintensität und der Psl-Antikörperbindung innerhalb von P. aeruginosa-Biofilmen wurde, wie zuvor hierin beschrieben, unter Verwendung von Volocity berechnet. Um die Aggregation von P. aeruginosa zu messen, wurde das Verhältnis von Oberfläche zu Biovolumen mithilfe der Comstat2-Software als Plugin für ImageJ quantifiziert, wie zuvor beschrieben33.

Die Zellstoffwechselaktivität von P. aeruginosa-Biofilmen wurde mithilfe eines angepassten ATP-Assays bewertet, der zuvor beschrieben wurde6,35. Kurz gesagt, P. aeruginosa wurde über Nacht in kationenangepasster Muller-Hinton-Brühe (CAMHB) (standardisiertes Medium für antimikrobielle Empfindlichkeitstests) bei 37 °C unter Schütteln (225 U/min) gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde 1:100 in CAMHB verdünnt und dann bis zu einer frühen logarithmischen Phase von 0,1 OD bei 600 nm gezüchtet. Von dieser Kultur wurden 220 µL in die Vertiefungen einer weißen Greiner Medium Binding 96-Well-Platte (Sigma-Aldrich, Oakville, ON) in Abwesenheit oder Anwesenheit von 5 % Sputumüberstand gegeben und dann 24 Stunden lang bei 37 °C ohne Sputumüberstand inkubiert zittern. Nach der Inkubation wurden die Medien entfernt und 200 µl CAMHB in Abwesenheit oder Anwesenheit von Sputumüberstand (endgültige Sputumverdünnung 5 %) und Tobramycin (endgültige Konzentration 1000 µg/ml) in die vorgesehenen Vertiefungen gegeben und dann 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert C. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und die Vertiefungen zweimal mit CAMHB gewaschen und 100 µL CAMHB wurden wieder in die Vertiefungen gegeben. Um ATP in der zellgebundenen Fraktion der Vertiefungen zu messen, wurde der Boden jeder Vertiefung durch Abschaben aufgebrochen und 100 µL Bac Titer-Glo™-Reagenz (Promega, Madison, WI) hinzugefügt. Die Platten wurden vorsichtig 10 Minuten lang im Dunkeln auf einem Orbitalschüttler gemischt, bevor die Lumineszenzmessung gemäß dem Protokoll des Herstellers erfolgte. Dieses Verfahren wurde wiederholt, um für jedes P. aeruginosa-Isolat drei biologische Replikate zu erhalten.

Die Rohdaten der Sequenzierung des gesamten Genoms wurden mit TRIMMOMATIC mit den Parametern LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:80 gekürzt. Wir verwendeten SKA, um Proben von Patienten vor und nach der Behandlung zu vergleichen. Um die MLST-Profile (Multi-Locus Sequence Typing) zu identifizieren, verwendeten wir die Ska-Typ-Funktion und für die Erkennung von Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) und die Distanzschätzung zwischen Proben verwendeten wir Ska-Fastq-, Vergleichs-, Zusammenführungs- und Distanzfunktionen. In jedem Fall wurden Standardparameter verwendet37,38.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad 5.0 durchgeführt. Kontinuierliche Variablen wurden mithilfe des nichtparametrischen Mann-Whitney-Tests verglichen. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Diese Studie wurde vom SickKids Research Ethics Board (REB#1000079038) genehmigt; Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt und die Forschung in Übereinstimmung mit allen relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Alle Bilder, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in den ergänzenden Materialien als ergänzende Abbildung 2 verfügbar. Alle genomischen Daten sind über die BioProject-ID verfügbar: PRJNA867399 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/867399) .

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Diese Studie wurde von der Cystic Fibrosis Foundation (CFF WATERS19AO-1) und Glyconet (ID-03) finanziert. MRP wird von der Cystic Fibrosis Foundation (CFF PARSEK17IO) finanziert.

Translationale Medizin, Forschungsinstitut, Krankenhaus für kranke Kinder, Toronto, ON, Kanada

Amanda J. Morris, Subin Park, Shafinaz Eisha und Valerie J. Waters

Abteilung für Mikrobiologie, Abteilung für pädiatrische Labormedizin, Krankenhaus für kranke Kinder, Universität Toronto, Toronto, ON, Kanada

Yvonne CW Yau

Abteilung für Atemwegsmedizin, Krankenhaus für kranke Kinder, Toronto, ON, Kanada

Nancy McDonald

Abteilung für Mikrobiologie, University of Washington, Seattle, WA, USA

Matthew R. Parsek

Programm für Molekulare Medizin, Forschungsinstitut, Krankenhaus für kranke Kinder, Toronto, ON, Kanada

P. Lynne Howell

Abteilung für Biochemie, University of Toronto, Toronto, ON, Kanada

P. Lynne Howell

Abteilungen für Pädiatrie und Mikrobiologie, University of Washington, Seattle, WA, USA

Lucas R. Hoffman

Meakins-Christie Laboratories, Forschungsinstitut des McGill University Health Centre, Montreal, QC, Kanada

Dao Nguyen

Medizinische Fakultät, McGill University, Montreal, QC, Kanada

Dao Nguyen

Impfstoffe und Immuntherapien, Biopharmazeutika-Forschung und -Entwicklung, AstraZeneca, Gaithersburg, MD, USA

Antonio DiGiandomenico

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Medizin, Universität Toronto, Toronto, ON, Kanada

Ashley M. Rooney und Bryan Coburn

Abteilung für Zell- und Systembiologie, University of Toronto, Toronto, ON, Kanada

Lucia Grana-Miraglia, Pauline Wang und David S. Guttman

Abteilungen für mikrobielle Infektion und Immunität, Mikrobiologie, Ohio State University, Columbus, OH, USA

Daniel J. Wozniak

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Pädiatrie, Krankenhaus für kranke Kinder, 555 University Avenue, Toronto, ON, M5G 1X8, Kanada

Valerie J. Waters

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AJM, SP, SE, AR, LG und PW führten die Experimente durch. NM hat die Sputumproben erhalten. AJM, SP, SE, AR, LG, PW, YCWY, PLH, MRP, LRH, DN, DSG, BC, DJW und VW trugen zum Studiendesign, zur Dateninterpretation und -analyse sowie zum Verfassen des Manuskripts bei. AD steuerte experimentelles Material bei und trug zum Verfassen des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Valerie J. Waters.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Morris, AJ, Yau, YCW, Park, S. et al. Die Aggregation von Pseudomonas aeruginosa und die Psl-Expression im Sputum sind mit einem Versagen der Antibiotika-Eradikation bei Kindern mit Mukoviszidose verbunden. Sci Rep 12, 21444 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25889-6

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Eingegangen: 04. Oktober 2022

Angenommen: 06. Dezember 2022

Veröffentlicht: 12. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25889-6

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