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Jul 22, 2023

Gezielte Abgabe einer PD

BMC Medicine Band 21, Artikelnummer: 327 (2023) Diesen Artikel zitieren 231 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details CD133 gilt als Marker für Krebsstammzellen (CSCs) in verschiedenen Tumorarten.

BMC Medicine Band 21, Artikelnummer: 327 (2023) Diesen Artikel zitieren

231 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

CD133 gilt als Marker für Krebsstammzellen (CSCs) in verschiedenen Tumorarten, einschließlich hepatozellulärem Karzinom (HCC). Chimäre Antigenrezeptor-spezifische T-Zellen (CAR-T), die auf CD133-positive CSCs abzielen, haben sich als Instrument für die klinische Behandlung von HCC herausgestellt, aber Immunogenität, die hohen Kosten rekombinanter viraler Vektoren in klinischer Qualität und mögliche Insertionsmutagenese schränken ihre klinische Anwendung ein .

CD133-spezifische CAR-T-Zellen, die PD-1-blockierendes scFv sezernieren (CD133 CAR-T- und PD-1 s-Zellen), wurden unter Verwendung eines Dornröschen-Transposonsystems der Minicircle-Technologie und der Antitumorwirksamkeit von CD133 CAR-T und PD-1 konstruiert s-Zellen wurden in vitro und in vivo analysiert.

Eine univariate Analyse zeigte, dass die CD133-Expression bei männlichen Patienten im Spätstadium (II und III) signifikant mit einem schlechteren progressionsfreien Überleben (PFS) (P = 0,0057) und einem schlechteren Gesamtüberleben (OS) (P = 0,015) verbunden war, und a Die multivariate Analyse zeigte einen Trend zu einem schlechteren Gesamtüberleben (P = 0,041). Männliche Patienten mit fortgeschrittenem HCC zeigten einen etwa 20-fach höheren PD-L1 Combined Positive Score (CPS) im Vergleich zu Patienten mit HCC in einem frühen Stadium. Wir haben erfolgreich CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen generiert, die PD-1-blockierendes scFv absondern konnten, basierend auf einem Dornröschensystem mit Minicircle-Vektoren. CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen zeigten in vitro und in Xenotransplantat-Mausmodellen eine signifikante Antitumoraktivität gegen HCC. Daher könnten CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen eine therapeutisch anwendbare Strategie zur Bekämpfung von CD133-positiven CSCs bei männlichen Patienten mit fortgeschrittenem HCC sein.

Unsere Studie liefert eine nichtvirale Strategie für die Konstruktion von CAR-T-Zellen, die auch Checkpoint-Blockade-Inhibitoren basierend auf einem Dornröschen-System aus Minicircle-Vektoren sezernieren könnten, und zeigte einen potenziellen Nutzen dieser Strategie für männliche Patienten mit fortgeschrittenem HCC und hoher CD133-Expression (medianer immunhistochemischer Score) auf > 2,284).

Peer-Review-Berichte

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die häufigste primäre bösartige Erkrankung der Leber und die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache weltweit [1]. Trotz der Evaluierung vieler Chemotherapien und gezielter Therapeutika sind Sorafenib, Regorafenib und Lenvatinib die einzigen bewährten Behandlungen für fortgeschrittene Erkrankungen, und die Gesamtüberlebensvorteile sind bescheiden [2]. Kürzlich wurden zwei Inhibitoren des programmierten Zelltodproteins 1 (PD-1), Pembrolizumab [3] und Nivolumab [4], für die HCC-Behandlung bei Patienten zugelassen, bei denen es nach der Einnahme von Sorafenib zu einer Progression kam, ihre Ansprechraten (ca. 20 %) waren jedoch ebenfalls gleich unbefriedigend [5]. Daher ist eine neue Behandlungsstrategie, die den klinischen Nutzen für HCC verbessert, dringend erforderlich.

Rezidive und Metastasen sind häufige und erwartete Ereignisse nach einer systemischen Therapie bei Patienten, die mit aktuellen Behandlungen für fortgeschrittenes HCC behandelt werden. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die meisten systemischen Therapien die primäre Tumorlast nur verringern können, weil Krebsstammzellen (CSCs) über intrinsische Mechanismen verfügen, um herkömmlichen oder neuartigen Therapien zu widerstehen, und ruhende CSCs für die Entstehung, das Wiederauftreten und die Metastasierung von Tumoren verantwortlich sind (6, 7). Neben dem Vorhandensein CD133-positiver HCC-Stammzellen [8] weist eine wachsende Zahl von Studien darauf hin, dass die CD133-Expression mit Tumoren im höheren Stadium und einer schlechten Prognose bei HCC-Patienten korreliert [9, 10], was auf eine vielversprechende Strategie hindeutet Verwendung von CD133 als Ziel für die HCC-Behandlung. Chimäre Antigenrezeptor-spezifische T-Zellen (CAR-T), die auf CD133-positive CSCs abzielen, haben sich als Instrument für die klinische Behandlung von HCC herausgestellt (NCT02541370).

Die auf CAR-T-Zellen basierende Immuntherapie bei Krebserkrankungen basiert auf der stabilen Integration eines Transgens in das Wirtsgenom, sodass infundierte gentechnisch veränderte Nachkommen langfristige therapeutische Wirkungen erzielen können. Bisher werden die meisten CAR-T-Zelltherapien über herkömmliche virale Vektorsysteme hergestellt, die in großem Umfang und sicher zum Einfügen von Transgenen in T-Zellen eingesetzt werden. Allerdings sind die Immunogenität, die hohen Kosten rekombinanter viraler Vektoren in klinischer Qualität und die Möglichkeit einer Insertionsmutagenese begrenzend ihre klinische Anwendung [11, 12]. Nichtvirale Gentransfersysteme sind attraktive Alternativen zu aktuellen Methoden zur Herstellung von CAR-T-Zellen. Die häufigsten Alternativen zu viralen Vektoren sind Transposons. Für die Produktion von CAR-T-Zellen wurde über eine Vielzahl transposonbasierter Systeme berichtet. Diese Systeme bieten eine geringere Immunogenität, verbesserte Sicherheitsprofile und geringere Kosten für die GMP-Herstellung von CAR-T-Zellen. Von den verfügbaren Technologien, die sich derzeit in klinischen Studien befinden, hat das Dornröschen-Transposonsystem (SB) von seiner Einführung bis zur Anwendung beim Menschen die schnellste Entwicklung durchlaufen [13]. Minicircles (MCs) sind superspiralisierte DNA-Vektoren, die eine neuartige Alternative zu Plasmiden als Quellen für SB-Transposasen und Transposons darstellen. Im Vergleich zu herkömmlichen Plasmiden fehlen MCs bakterielle Rückgratsequenzen und Antibiotikaresistenzgene, was bei der Transfektion in Säugetierzellen zu einer stabileren und höheren transienten Genexpression führt [14, 15].

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von CD133-spezifischen CAR-T-Zellen, die PD-1-blockierendes Single-Chain-Variable-Fragment (scFv) sezernieren, das auf HCC-Zellen abzielt, unter Verwendung eines SB-basierten nichtviralen genetischen Modifikationssystems, das MC-Transposon-Donorvektoren einbezieht, um das zu vereinfachen aktuelles Produktionsprotokoll für CAR-T-Zellen. Unser Ziel war es, mithilfe unserer CD133-spezifischen CAR-T-Zellplattform eine Einzeltherapie gegen fortgeschrittenes HCC zu entwickeln, bei der PD-1-blockierendes scFv lokal an die Tumorstelle abgegeben wird, um die Toxizität zu minimieren.

Für die immunhistochemische (IHC) Färbung wurden 67 Proben von Patienten mit hepatozellulärem Karzinom (HCC), bestehend aus benachbarten nicht krebsartigen Geweben und HCC-Tumorgeweben, von Patienten entnommen, die sich zwischen 2005 und 2008 einer primären HCC-Resektion am Sun Yat-sen University Cancer Center unterzogen. Diese Patienten erhielten keine präoperative Chemotherapie oder Strahlentherapie. Darüber hinaus umfasste die Studie 26 Fälle von Lungenmetastasen, die bei Patienten gesammelt wurden, die sich zwischen 2003 und 2021 im selben Zentrum einer Lungenmetastasenresektion unterzogen hatten.

Bei allen in der Studie verwendeten menschlichen Proben handelte es sich um archivierte Materialien, die mit Einverständniserklärung der Patienten erhalten wurden. Die Verwendung dieser Proben wurde vom Institutional Review Board von SYSUCC genehmigt (Genehmigungsnummer GZR2019-287).

Die in dieser Studie verwendeten Plasmide wurden von vectorbuilder.com individuell geklont. Die folgenden SB-Transposon-Genexpressionsvektoren wurden verwendet:

pSB-EF1alpha-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-P2A-PD-1 blockiert scFv-WPRE-BGH polyA

Das aus HW350341.1 in einer früheren Studie [16] abgeleitete Anti-CD133-scFv wird unter der Kontrolle des EF1-Alpha-Promotors exprimiert. Um die Effizienz des Gentransfers und die Sekretion von PD-1-blockierendem scFv zu beurteilen, haben wir einen c-Myc-Tag (GAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTG) zwischen CD133-scFv und CD8TM bzw. am Ende von PD-1-blockierendem scFv eingefügt. Die CD133-CAR- und PD-1-blockierenden scFv wurden durch eine P2A-Peptidsequenz verknüpft. Um die Genexpression zu erhöhen, platzierten wir ein posttranskriptionelles regulatorisches Element (WPRE) des Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus zwischen dem Stoppcodon und dem PolyA-Signal des bovinen Wachstumshormons (BGH). Die invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) mit spezifischer Bindung an SB-Transposase, die in einer früheren Studie identifiziert wurden (17), wurden vor EF-1α und am Ende von BGH-PolyA platziert. Die Sequenz von pSB-EF1alpha-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-P2A-PD-1, die scFv-WPRE-BGH polyA blockiert, wurde ebenfalls wie in der Zusatzdatei 1 angehängt.

pSB-EF1alpha-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z -WPRE-BGH polyA

Um die Effizienz von Anti-CD133-CAR-T-Zellen und Anti-CD133-CAR-T-Zellen, die PD-1-blockierendes scFv sezernieren, zu vergleichen, konstruierten wir auch Anti-CD133-CAR-T-Zellen mit der gleichen Struktur wie in (1) beschrieben, ohne die PD- 1 blockierender scFv.

pSB-CMV-Promotor-SV40-Intron-SB100 × -SV40-Poly(A)-Signal

pCMV(CAT)T7-SB100 wurde von Addgene erworben (Katalognummer 34879). Wir verwendeten homologe Rekombination CMV-Promotor-SV40-Intron-SB100 × -SV40-Poly (A) in MCS-Stellen in einem Parental Minicircle Cloning Vector (pMC. BESPX-MCS2, Katalognummer MN100B-1, System Biosciences).

pMC.BESPX-MCS2

pMC.BESPX-MCS2 ist ein leerer parentaler Minicircle-Klonierungsvektor (Katalognummer MN100B-1, System Biosciences), der zur Herstellung von Minicircles aus Transposons und Transposasen verwendet wurde.

Minicircle-Produktionsstamm

ZYCY10P3S2T E. coli (Katalognummer MN900A-1, System Biosciences) war die kompetente Zelle, die für die Minicircle-Produktion verwendet wurde.

Wir haben zuerst das SB-Transposon pSB-EF1alpha-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-P2A-PD-1, das scFv-WPRE-BGH polyA blockiert, pSB-EF1alpha-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-WPRE-BGH polyA und SB100 × Transposase in kloniert die MCS-Stellen des parentalen Minicircle-Klonierungsvektors (pMC.BESPX-MCS2), 200 ng des Plasmids in ein Fläschchen ZYCY10P3S2T E. coli geben, indem die Pipettenspitze während der Abgabe vorsichtig durch die Zellen gedreht wurde, 30 Minuten auf Eis inkubiert, setzten die Zellen 30 s lang einem Hitzeschock in einem 42 °C warmen Wasserbad aus und legten die Zellen dann 2 min lang auf Eis. Wir fügten 0,2 ml SOC-Medium bei Raumtemperatur hinzu, überführten die Probe in ein Bakterienkulturröhrchen und inkubierten die Zellen unter Schütteln bei 250 U/min (37 °C) für 60 Minuten. Vorgewärmte LB-Kulturplatten zur Kanamycin-Selektion (50 µg/ml Kanamycin) wurden dann mit 50–200 µl Bakterien bestrichen. Die Zellen wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 3–5 Kolonien gepflückt und in 2 ml LB mit 50 μg/ml Kanamycin gezüchtet. Die Zellen wurden über Nacht gezüchtet, das Plasmid wurde durch Miniprep extrahiert und das Minicircle-Elternplasmid wurde bewertet.

Eine einzelne Kolonie wurde in 2 ml LB mit 50 μg/ml Kanamycin aufgenommen und dann 4–6 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln bei 250 U/min inkubiert. Dann wurden 0,5–1 ml bis 200 ml 1 × Wachstumsmedium hinzugefügt. Die Platten wurden wieder in einen Inkubator bei 30 °C gestellt und über Nacht bei 250 U/min geschüttelt.

Nach dem Wachstum über Nacht wurden der pH-Wert und die OD600 des Kulturmediums gemessen. Der angestrebte pH-Wert lag bei etwa 7 und die angestrebte OD600 bei 4–6. Dann wurden 400 ml der Übernachtkultur mit 400 ml 1 × Induktionsmedium (400 ml frisches LB-Medium, 16 ml 1 N Natriumhydroxid und 0,4 ml 20 % L-Arabinose) kombiniert. Die Mischung wurde erneut bei 32 °C inkubiert und 5 Stunden lang bei 250 U/min geschüttelt. Die gesamte Induktionszeit betrug 5 Stunden. Ein Milliliter der Bakterienkultur wurde zur Durchführung einer Minipräparation verwendet, gefolgt von einer Restriktionsverdauungsanalyse, um die Qualität des Minicircle-Plasmids zu überprüfen. Die Bakterien wurden bei 4 °C pelletiert und das Pellet bei –80 °C gelagert.

Zur Extraktion des Plasmids aus dem Bakterienpellet wurde ein Endotoxin-freies Plasmid-Extraktionskit (Katalognummer DP117, TIANGEN) verwendet. Anschließend wurde das Plasmid mithilfe der Restriktionsstelle SalI geschnitten, um zu beurteilen, ob der Minicircle erfolgreich induziert wurde. Die Minicircle-Größe war kleiner als die des Elternplasmids und es gab keine Kontamination mit dem Elternplasmid.

PBMCs wurden von Freiwilligen erhalten und Buffy Coats wurden von MD Pacific Cell Separation Media (MD Pacific, Tianjin, China) erhalten. Nach der Erythrozytenlyse (Beyotime, China) wurden T-Zellen mit dem Pan T Cell Isolation Kit (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Deutschland) isoliert. Anschließend wurden T-Zellen über Nacht durch Anti-CD3/CD28-Perlenstimulation (Stemcell, USA) aktiviert. Die Transfektion von Transposon- und Transposase-Vektoren in 1 × 107 T-Zellen wurde am zweiten Tag mit einem 4D-Nukleofektor gemäß den Anweisungen des Herstellers (Lonza, Köln, Deutschland) durchgeführt. Die Elektroporation wurde mit dem Amaxa™ P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit L (24 RCT) durchgeführt. Kurz gesagt, 1 × 107 Zellen wurden in 100 μl Nukleofektionspuffer suspendiert, der die angegebenen Mengen an Transposon- und Transposase-Vektor-DNA enthielt. Programm E0-115 wurde angewendet und die Zellen wurden sofort mit 3 ml Medium (X-vivo) mit 1000 IU/ml rekombinantem humanem Interleukin (IL)-2, IL-7 und IL-15-Kultur für 2–3 Tage versorgt . Achtundvierzig bis zweiundsiebzig Stunden nach der Elektroporation wurden die Zellen in 2 ml frischem Medium (X-vivo) mit 400 IU/ml rekombinantem humanem Interleukin (IL)-2 (Four Rings Biopharmaceutical, Peking, China) resuspendiert und mit expandiert Rekombinantes Proteinantigen CD133 (R and D Systems, USA) und CD28 für 2–3 Tage. Die CAR-T-positiven Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie über den c-Myc-Tag ausgewertet, mit Biotin-konjugiertem c-Myc-Tag (CST, USA) und Anti-Biotin-Kügelchen (Miltenyi, Deutschland) angereichert und für bis zu 100 % expandiert 21 ~ 28 Tage. Die IL-2-Konzentration wurde 3–4 Tage vor der Funktionsanalyse auf 40 IU/ml reduziert.

Lentivirale Bestände wurden durch Transfektion von 293 T-Zellen mit den Luciferase-, Blasticidin- und Puromycin-Plasmiden pMD2.G und pSPAX (Addgene) erzeugt. Für den lentiviralen Gentransfer in Tumorzelllinien wurden den Tumorzellen 20 μl Lentivirus zugesetzt. Zwei Tage nach der Infektion wurden die positiven Tumorzellen mittels Blasticidin selektiert. Für den lentiviralen Gentransfer in T-Zellen wurde eine MOI von 10 verwendet, um primäre T-Zellen von Freiwilligen zu infizieren. Nach der Sortierung mit Puromycin wurden PD + 1 T-Zellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt.

Die Montageobjektträger wurden 2,5 Stunden lang bei 65 °C inkubiert, hydratisiert, in 3 % H2O2 repariert, in Ziegenserum blockiert, mit dem primären Antikörper gegen CD133 (Invitrogen, Katalognummer PA5-82,184, Verdünnung 1:250) inkubiert und dann mit dem sekundären Antikörper (Dako, Agilent) inkubiert. Die Objektträger wurden mit einem digitalen Pathologie-Schnittscanner (KFBIO, Ningbo, China) gescannt, um einen vollständigen Scan zu erhalten. Die vergrößerte Ansicht wurde unter einem Mikroskop (Nikon Eclipse Ni-U) fotografiert.

Die semiquantitative Bewertung wurde wie folgt durchgeführt: 0 für die Färbung bei ≤ 1 % der Krebszellen, 1 für die Färbung bei 2–25 % der Krebszellen, 2 für die Färbung bei 26–50 % der Krebszellen, 3 für die Färbung bei 51–75 % von Krebszellen und 4 für die Färbung in ≥ 75 % der Krebszellen. Die Färbungsintensität wurde wie folgt bewertet: 0, keine Färbung; 1, schwache Färbung; 2, mäßige Färbung; und 3, starke Färbung.

Die Expression des tumorprogrammierten Todesliganden 1 (PD-L1) wurde mithilfe eines PD-L1-Immunhistochemie-(IHC)-SP142-Antikörperklons (Abcam, 228.462) und eines kombinierten positiven Scores (CPS) bewertet. CPS, eine hoch reproduzierbare PD-L1-Bewertungsmethode für mehrere Tumortypen [18, 19], wird erhalten, indem die Anzahl der PD-L1-gefärbten Zellen (Tumorzellen, Lymphozyten, Makrophagen) summiert und das Ergebnis durch die Gesamtzahl dividiert wird Anzahl lebensfähiger Tumorzellen und multipliziert mit 100 und CPS/gesamte Tumorfläche basierend auf der folgenden Formel:

Um festzustellen, ob die CAR-T-Zellen solide Tumoren infiltriert haben, wurde ein CD3-Antikörper (Katalognummer ZM-0417–6.0, OriGene, Arbeitslösung) verwendet, um zu beurteilen, ob die T-Zellen in solide Tumoren infiltriert waren.

Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Transduktionseffizienz transduzierter Zellen nach Färbung mit PE-konjugiertem c-Myc-tag (CST, Klon 71D10), 7AAD und APC-Cy7-konjugiertem Kaninchen-Anti-Human-CD3 (BD ​​Biosciences, Klon SK7, APC-Cy7). Daten von Zellen wurden mit einem Beckman Coulter Gallios Durchflusszytometer gesammelt und mit CytExpert (Beckman) analysiert. Zur Analyse von CAR-T-Zellen im In-vitro-Experiment wurden die folgenden Antikörper und Reagenzien für die Durchflusszytometrie verwendet, um naive T-, Effektor-T-, zentrale Gedächtnis-T- und Effektor-Gedächtnis-T-Zellen zu unterscheiden: APC-Cy7 anti-human CD3, PE Anti-c-Myc-Tag (CST, Klon, 71D10), APC-CD8 (BD, Klon, HIT8α), FITC-CD45RA (BD, Klon, L48) und PECy7-CCR7 (BD, Klon, 3D12). Die folgenden Antikörper wurden verwendet, um die Häufigkeit von Tregs unter CD4-T-Zellen im In-vitro-Experiment zu bewerten: APC-Cy7 Anti-Human-CD4 (BD, Klon, RPA-T4), APC-Anti-Human-CD25(BD, Klon, M- A251) und FITC-Anti-Human-Foxp3 (BioLegend, Klon, 206D).

Um die Inkubation von CAR-T- und Hep3B-Zellen zu bewerten, wurden APC-Cy7-CD3 und PE-CD133 (Miltenyi, Klon, REAL803) zur Unterscheidung von CAR-T- und Hep3B-Zellen verwendet. PD-1-APC (BD, Klon, MIH4) wurde zur Bewertung der PD-1-Expression verwendet. Um den PD-1-blockierenden scFv-Bystander-Effekt zu bewerten, wurde c-Myc-markiertes PE verwendet, um den Überstand von CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen, die mit PD-1 + T-Zellen inkubiert wurden, als PE-konjugierte Anti- Der c-Myc-Tag-Antikörper kann an PD-1-blockierendes scFv binden.

Um die CD107a-Expression zu bewerten, wurden dem Medium vor der Analyse auf 4 mit Hep-3B inkubierte CAR-T-Zellen, der CD107a-Antikörper (BD, Klon, H4A3) und ein Leukozytenaktivierungscocktail mit BD GolgiPlugTM (BD) und Monensin (BioLegend) zugesetzt H.

Um zu bewerten, ob das PD-1-scFv die Funktion von PD-1 + T-Zellen wiederherstellen kann, wurde FVS780 (BD, lebende/tote Zellen) verwendet, um tote Zellen auszuschließen. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit CD3 PE (BD, Klon, HIT3α) gefärbt. Die intrazelluläre Färbung für Granzyme B BV421 (BD, Klon, GB11) und TNFα APC (BD, Klon, MAb11) wurde schließlich gemäß dem Protokoll des Herstellers (BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Solution Kit, Nr. 554714) durchgeführt.

Um T-Zellen zu bewerten, die in die Tumorumgebung eingedrungen sind, wurde der Tumor mit einer Rasierklinge so fein wie möglich zerkleinert; Anschließend wurde es 1 Stunde lang mit Kollagenase I und IV (Yeason: #40507ES60 und #40510ES60), Dispase II (Yeason: #40104ES80) und DNase I (Yeason: #10607ES15) in 1640-Medium verdaut, um einzelne Zellen zu produzieren. Die roten Blutkörperchen wurden lysiert und dann einer CD3-APC-Färbung (BD, Klon, UCHT1) und einer Lebend-/Tot-FVS780-Färbung unterzogen.

Kontinuierliche Zytotoxizitätstests mit CAR-T-Zellen wurden mit einem xCELLigence Real-Time Cell Analyzer-Multiple Plate-System (Agilent Technologies) durchgeführt. Kurz gesagt, 11.000 Hep-3B-Zellen wurden in jede Vertiefung einer 16-Well-Platte (Agilent, Nr. 20220922) gegeben. Nach etwa 24 Stunden wurden entsprechende CAR-positive Zellen mit unterschiedlichen Effektor-Ziel-Verhältnissen (E:T) hinzugefügt. Die Zellindexwerte, die Änderungen der elektrischen Impedanz darstellen und die Anzahl der überlebenden Zielzellen auf biokompatiblen Mikroelektrodenoberflächen widerspiegeln, wurden alle 15 Minuten mit der RTCA-Software berechnet. Die Zellindexdaten jeder Gruppe stellen den Mittelwert von 4 Wells dar.

Die quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qPCR) wurde verwendet, um die Expressionsniveaus der CAR-Fusionsgene gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll zu bewerten. Ein 153-bp-Fragment (Basenpaar), das Teile der CD8-α-Kette und der angrenzenden CD137-Kette enthielt, wurde unter Verwendung eines Vorwärtsprimers 5'-GGTCCTTCTCTGTCACTGGTT-3′ und eines Rückwärtsprimers 5′-TCTTCTTCTTCTGG AAATCGGCAG-3′ amplifiziert, um das CAR-Gen nachzuweisen. Die Amplifikation von GAPDH wurde als interne Kontrolle und zur Normalisierung der DNA-Mengen verwendet. qPCR wurde mit dem Fast All-in-One RT Kit mit SYBR Green Master Mix (ES Science) durchgeführt und auf einem LightCycler 480 (Roche) ausgeführt.

Um zu zeigen, dass CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen PD-1-blockierendes scFv sezernieren können, wurden CAR-T-Zellen 20 Minuten lang bei 4 ° C und 2000 × g zentrifugiert. Dann wurde der Überstand von Mock-T-, CD133-CAR-T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen unter Verwendung eines Millipore-Systems (10 kd) konzentriert und 15–20 Minuten lang bei 4000 g zentrifugiert, bis die verbleibende Flüssigkeit vorhanden war ca. 200 µl. Dann wurde RIPA (Sigma) enthaltender Proteaseinhibitor 15 Minuten lang auf Eis gegeben und PD-1-blockierendes scFv wurde unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-c-Myc-Tag-Antikörpers (CST, Kat. 14.038, 1:1000) nachgewiesen. Der Antikörpernachweis wurde mit Pierce ECL Western Blot-Substrat (Tanon) erreicht. Um festzustellen, ob die CAR-Gene in T-Zellen integriert sind, wurden endogenes CD3-Zeta und Exo-CD3zeta unter Verwendung von Anti-CD3-ζ (Santa Cruz Biotechnology, Klon 6B10.2, 1:200) nachgewiesen.

Die Überstände von Schein-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen, die 24 Stunden lang mit Tumorzellen im Verhältnis 1:1 inkubiert wurden, wurden gesammelt und bei –80 °C gelagert. Der Überstand wurde dann aufgetaut und die IFNγ-, TNFα- und IL-2-Konzentrationen wurden gemäß den Protokollen des Herstellers (Dakewe Biotech) nachgewiesen.

Die mit dem Lentivirus konstruierten PD-1 + T-Zellen wurden zwei- bis dreimal mit kaltem PBS gewaschen und mit Spitzen wurden T-Zellen auf einen Objektträger gelegt. Die Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit PBS gewaschen, mit 1 % Triton 647 direkt oder mit dem kondensierten Überstand von CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen inkubiert und dann mit c-Myc-tag-647 inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mit einem Nikon Eclipse Ti2 beurteilt.

Alle Experimente wurden unter Einhaltung aller relevanten ethischen Vorschriften und in Übereinstimmung mit einem vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokoll (Nr. 18080B) durchgeführt. NCG-Mäuse (GuangDong GemPharmatech Co., Ltd.) im Alter von 4–6 Wochen wurden subkutan mit 2,5 × 106 Tumorzellen (Hep-3B-luc) inokuliert, und nachdem der Tumor auf 50–100 mm3 angewachsen war, wurden Mock T, CD133 CAR- T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen wurden NCG-Mäusen intravenös mit Hep-3B injiziert. Für metastasierte Mausmodelle wurden den NCG-Mäusen 2,5 Millionen Hep3B-luc-Zellen intravenös injiziert. Die Metastasierung wurde durch Biolumineszenzbildgebung (BLI) bestätigt und dann mit einer Schwanzschleierinjektion von 5 Millionen Mock-T-, CD133-CAR-T- oder CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelt. Die BLI des Tumorwachstums wurde mit einem IVIS-Bildgebungssystem von PerkinElmer und der Living Image-Software durchgeführt. Abschließend wurde das Tumorgewicht bewertet. Mäuse wurden eingeschläfert, wenn das Tumorvolumen 2000 mm3 erreichte oder wenn sie Anzeichen einer Krankheit zeigten. Zur Etablierung eines In-situ-Xenotransplantat-Tumormodells wurden 2,5 Millionen Hep3B-luc-Zellen direkt in die Leber von NCG-Mäusen injiziert. Der Tumor wurde durch BLI bestätigt und 5 Millionen Mock-T-, CD133-CAR-T- oder CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen wurden in die Schwanzvene injiziert. Die BLI des Tumorwachstums wurde mit einem IVIS-Bildgebungssystem von PerkinElmer und der Living Image-Software durchgeführt.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism Software (GraphPad Software Inc., Version 8.02) und SPSS (IBM, Version 25.0) durchgeführt, mit Ausnahme der Überlebenskurven, die mit der Kaplan-Meier-Überlebensmethode erstellt und mit dem Log-Rank-Test verglichen wurden mit der Programmiersprache R. Für den Vergleich zweier Gruppen wurden zweiseitige ungepaarte t-Tests verwendet. Die einfaktorielle ANOVA wurde für Vergleiche von drei oder mehr Gruppen unter einer einzigen Bedingung verwendet. Die Faktoren, die OS und PFS vorhersagen, wurden mittels univariater und multivariater Cox-Proportional-Hazard-Regressionsmodellanalysen bewertet. Unterschiede wurden wie folgt als statistisch signifikant angesehen: *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001.

Um die Eignung von CD133 als Ziel für die CAR-T-Zelltherapie bei HCC zu bewerten, analysierten wir zunächst die CD133-Proteinspiegel in 67 HCC-Patientenproben (Stadium I, 36 Fälle; Stadium II, 7 Fälle; Stadium III, 24 Fälle; Stadium IV). , 26 Lungenmetastasenfälle) und passendes angrenzendes Gewebe mittels IHC-Assay. Die CD133-Expression wurde in vier Stufen eingeteilt: negativ (0), schwach (weniger als 5), mäßig (5–10) und stark (mehr als 10) (Abb. 1A) und wurde weiter in CD133-hoch oder CD133- unterteilt. niedrige Expression anhand des mittleren IHC-Scores (2,284). Eine hohe Expression von CD133 konnte in 19/67 (28,36 %) primären HCC-Geweben nachgewiesen werden, davon 8/36 (22,22 %) im Stadium I, 11/31 (35,48 %) im Stadium II und III und 13/26 (50,00 %). ) im Lungenmetastasenstadium (Abb. 1B). Die statistische Analyse ergab, dass CD133 signifikant mit der Invasion der Pfortader und AFP korrelierte (P = 0,002 bzw. P = 0,016; Zusatzdatei 2: Tabelle S1). Es gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen der CD133-Expression und Alter, Geschlecht, HBsAg, Leberzirrhose, Tumorgröße, Tumoranzahl, Tumoreinkapselung, histologischer Differenzierung, TNM-Stadium oder mikrovaskulärer Invasion (Zusatzdatei 2: Tabelle S1). Als nächstes analysierten wir den Einfluss der CD133-Proteinexpressionsniveaus auf das Überleben von HCC-Patienten. Obwohl bei allen Patienten kein signifikanter Zusammenhang zwischen der CD133-Expression und dem OS oder PFS bestand (Zusatzdatei 2: Abb. S1A, Tabelle S2), war die CD133-Expression im Spätstadium (II und III) bei männlichen Patienten signifikant mit dem PFS assoziiert ( P = 0,0057) und schlechteres OS (P = 0,015) in der univariaten Analyse (Abb. 1C und Zusatzdatei 2: Tabellen S3, S4), mit einem Trend zu schlechterem OS in der multivariaten Analyse (P = 0,041) (Zusatzdatei 2: Tabelle S4). Darüber hinaus zeigten Online-TCGA-Daten (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000007062-PROM1/pathology/liver+cancer) für HCC auch, dass die CD133-Expression bei Patienten im Spätstadium oder bei männlichen Patienten mit einem schlechteren OS korrelierte (Zusatzdatei 2: Abb . S1B). Diese Eigenschaften machen das CD133-Protein zu einem sinnvollen Ziel für die Immuntherapie bei männlichen Patienten mit fortgeschrittenem HCC. Um zu beurteilen, ob auch männliche Patienten mit fortgeschrittenem HCC von einer PD-1-Checkpoint-Blockade-Therapie profitieren, haben wir auch die PD-L1-Expression bei männlichen HCC-Patienten mithilfe der CPS-Methode untersucht. Zur Beurteilung der PD-L1-Expression wurden insgesamt 57 Objektträger (Stadium 1, Stadien 2 und 3 und Lungenmetastasen, 19 Objektträger jedes Stadiums) verwendet. Im Vergleich zu den Proben im Stadium I wurden für die Metastasen und Proben der Stadien II und III signifikant höhere CPS-Werte gefunden (P = 0,0024 bzw. P = 0,0356; Abb. 1D, E), was darauf hindeutet, dass männliche Patienten mit fortgeschrittenem HCC davon profitieren könnten PD-1/PD-L1-Checkpoint-Blockade-Therapie.

Repräsentatives Bild des CD133- und PD-L1-Nachweises in verschiedenen Stadien bei HCC-Patienten. A HE-Bilder und entsprechende CD133-Expression im Primärtumorgewebe bei Leberkrebspatienten und Lungenmetastasen. B Der Prozentsatz der CD133-Expression in Primärtumoren im frühen (Stadium I) und fortgeschrittenen Stadium (Stadium II und III) sowie in Metastasen in der Lunge. C Kaplan-Meier-Kurve, die Überlebensanalysen bei männlichen Patienten im Stadium II und III darstellt. Der P-Wert wurde durch den Log-Rank-Test berechnet. D Repräsentatives Bild der PD-L1-Expression in verschiedenen Stadien und in Lungenmetastasen von HCC-Patienten. E Die PD-L1-Expression in verschiedenen Stadien und in Lungenmetastasen von HCC-Patienten wurde mithilfe der CPS-Score-Methode bewertet und verglichen. Mittelwert ± SD, n = 19, zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, ns, nicht signifikant

Als nächstes wurden CD133-spezifische CAR-T-Zellen konstruiert, die den PD-1-blockierenden scFv-Antikörper sezernieren. Wir verwendeten ein SB-basiertes nichtvirales genetisches Modifikationssystem mit MC-Transposon-Spendervektoren, um das aktuelle Protokoll zur CAR-T-Zellproduktion zu vereinfachen. Die MC-kodierte Transposase wurde hergestellt, indem SB100 aus pCMV (CAT)T7-SB100 geschnitten und in die MCS-Klonstelle eines parentalen MC-Klonierungsvektors (pMC.BESPX-MCS2) eingefügt wurde. Das MC-kodierte Transposon wurde durch zwei Transposonvektoren hergestellt, die optimiertes CD133-CAR oder CD133-CAR und PD-1-blockierendes scFv mit c-Myc-Transduktionsmarkern exprimierten, und in die MCS-Klonstelle von pMC.BESPX-MCS2 eingefügt (Abb. 2A). . Diese Plasmide, die MC-kodierte Transposase und Transposons enthielten, wurden zur Produktion von MCs mit L-Arabinose rekombiniert, was zu einer Verringerung der Vektorgröße führte (Abb. 2B). Nach der Transfektion von Transposon- und Transposase-Vektoren in zwei Verhältnissen (3:1 und 1:1) in T-Zellen aus dem peripheren Blut gesunder Spender stellten wir fest, dass ein Verhältnis von 1:1 eine bessere Transfektionseffizienz und Zelllebensfähigkeit hatte. An den Tagen 5–10 beobachteten wir eine 5–9 %ige CAR-Transplantation von T-Zellen mit CD133-CAR oder CD133-CAR und PD-1, die scFv durch Elektrotransfektion blockierten (Abb. 2C), und die Lebensfähigkeit der Zellen betrug laut Beurteilung mehr als 75 % durch 7-AAD-Färbung (n = 3) (Abb. 2D). Ein Verhältnis von 3:1 führte zu einer geringeren Lebensfähigkeit der Zellen und die Zellen konnten in einer Langzeitkultur nicht bestehen bleiben (Zusatzdatei 2: Abb. S2A-C). Die Transfektionseffizienz blieb über mehr als 28 Tage erhalten oder steigerte sich (Abb. 2E). Um zu zeigen, dass PD-1 die scFv-Sekretion durch CD133-spezifische CAR-T-Zellen blockiert, wurde der konzentrierte Überstand der modifizierten T-Zellen gesammelt und durch Western Blot analysiert. Wir fanden heraus, dass nur die T-Zellen, die mit CD133-CAR und PD-1-blockierendem scFv transfiziert waren, das PD-1-blockierende scFv sezernieren konnten (Abb. 2F). Insgesamt zeigten diese Daten, dass CD133-spezifische CAR-T-Zellen, die PD-1-blockierendes scFv (CD133 CAR-T und PD-1 s) sezernieren, erfolgreich auf der Grundlage einer SB-vermittelten Transposition von MC-Transposon-Donorvektoren konstruiert wurden.

Konstruktion von CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen basierend auf Dornröschen-Transposons aus Minicircles. Ein schematisches Diagramm der CAR-T-Zellvorbereitung und Sequenzen von SB100-, CD133-CAR-T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen. B Die Minikreise aus CD133-CAR-, CD133- und PD-1-CAR- und SB100-Zellen wurden durch Agarosegelelektrophorese ausgewertet. C Repräsentative Durchflusszytometrie-Analysen der CAR-T-Zell-Expression unter Verwendung eines c-Myc-Tags, wie im Ersatz gezeigt. D Die Zelllebensfähigkeit von CAR-T-Zellen von 3 verschiedenen Spendern. Die E-CAR-Expression wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten bei drei verschiedenen gesunden Spendern nachgewiesen. Eine Farbe repräsentiert eine Patientenprobe. F Western-Blot-Nachweis des sekretierten PD-1-blockierenden scFv im Überstand von Mock-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen

Als nächstes analysierten wir die Antitumorwirksamkeit von CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen. CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen wurden zunächst mit einem biotinylierten Anti-c-Myc-Tag-Antikörper und dann mit Anti-Biotin-Mikrokügelchen durch positive Selektion inkubiert. Das CAR-Expressionsniveau betrug nach 7–11-facher Anreicherung mehr als 50 % (Abb. 3A). qPCR und WB bestätigten die CAR-Integration weiter (Abb. 3B). Das CD4/CD8-Verhältnis betrug ungefähr 3,5:1 und die meisten CAR-T-Zellen waren CD45RA-CCR7-T-Zellen (Abb. 3C). Die Analyse ergab Treg-Anteile von 38,4 bzw. 1,23 % unter CD133 CAR-T- und CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen (Zusatzdatei 2: Abb. S3), aber die CD4 + CD133 CAR-T- oder CD133 CAR- T- und PD-1-Zellen zeigten immer noch Antitumorfähigkeit (Zusatzdatei 2: Abb. S4). Zwei hepatozelluläre Zelllinien, SK-Hep1 (1 % CD133-Expression) und Hep3B (98,02 % CD133-Expression) (Abb. 3D), wurden zur Bewertung der zytotoxischen Aktivität ausgewählt. Der Antitumorvorteil von CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen wurde durch kontinuierliche Zytotoxizitätstests mit E:T-Verhältnissen von 1:1, 0,5:1 und 0,25:1 über 72 Stunden unter Verwendung eines xCELLigence Real-Time Cell Analyzer-Multiple bewertet Plattensystem (Agilent Technologies). Bei den gesamten T-Zellen zeigten die CD133-CAR-T- und PD-1-CAR-T-Zellen bei einem niedrigen E:T-Verhältnis von 0,25:1 eine größere Zytotoxizität als die CD133-CAR-T-Zellen (P = 0,0309) (Zusatzdatei 2). : Abb. S4A), wohingegen bei E:T-Verhältnissen von 1:1 und 0,5:1 (P = 0,9650 bzw. P = 0,1837) keine Unterschiede beobachtet wurden (Zusatzdatei 2: Abb. S4A). Diese Ergebnisse stimmten mit denen einer früheren Studie überein, die zeigte, dass PD-1-scFv-sekretierende CAR-T-Zellen bei einem niedrigen E:T-Verhältnis oder bei längerer Antigen-Expositionszeit eine größere Zytotoxizität aufwiesen als herkömmliche CAR-T-Zellen [20]. Um zu untersuchen, ob die CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen die Erschöpfung der CD133-CAR-T-Zellen verhindern können, verglichen wir die Zytotoxizität von CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und Mock-T-Zellen bei a niedriges E:T-Verhältnis von 0,25:1 laut Durchflusszytometrie. Die Zytotoxizität von CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen gegenüber der CD133-hochexprimierenden HCC-Zelllinie Hep3B war im Vergleich zu CD133-spezifischen CAR-T- und Mock-T-Zellen bei einem E:T-Verhältnis von 0,25:1 deutlich erhöht über Nacht (P = 0,002 und P <0,0001; Abb. 3E, F). Darüber hinaus waren der Prozentsatz an CD107a + T-Zellen (P = 0,0014; Abb. 3G, H) und die Produktion von IFNγ (P < 0,0001; Abb. 3I) in CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen im Vergleich zu erhöht CD133-spezifische CAR-T-Zellen. Insgesamt weisen CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen in vitro eine bessere Zytotoxizität auf als CD133-spezifische CAR-T-Zellen.

Erhöhte spezifische zytotoxische Wirkung von CD133 CAR-T- und PD-1 s-Zellen gegenüber CD133 + HCC-Zelllinien. Eine CAR-Expression in Mock-, CD133-CAR-T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen wurde durch Durchflusszytometrie nach Anreicherung mit Anti-c-Myc-tag-Biotin- und Anti-Biotin-Mikrokügelchen bewertet. B RT-QPCR- und Western-Blot-Analyse der CAR-Genzahl und der CD3ζ-Expression in Mock-T-, CD133-CAR-T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen. C Die CD8-positive Untergruppe der CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen und ihre CCR7- und CD45R-Expression mittels durchflusszytometrischer Analyse. D Durchflusszytometrie-Analyse der CD133-Expression in HCC-Zelllinien (SK-Hep-1 und Hep3B). E Die oberen Bilder zeigen Schein-T-, CD133-CAR-T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen, die auf Hep3B-Zellen abzielen. Der rote Pfeil repräsentiert die CAR-T-Zellen und der gelbe Pfeil repräsentiert den Tumor. Das untere Bild zeigt den Anteil von Mock-T-, CD133-CAR-T-Zellen oder CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen, die mit CD133 + HCC-Zelllinien (Hep3B) inkubiert wurden, nach 24 Stunden. F Spezifische Lyse (Verhältnis von 7AAD-positiven Zellen zu CD133 + Tumor-Gesamtzellen) nach 3 Tagen Inkubation von CAR-T-Zellen mit Tumorzellen. G Repräsentatives durchflusszytometrisches Bild der CD107a-Expression in Mock-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen, die 4 Stunden lang mit Tumorzellen inkubiert wurden. H Die Häufigkeit der CD107a-Expression auf Mock-T-, CD133-CAR-T-, CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen allein oder inkubiert mit Hep3B-Zellen mittels durchflusszytometrischer Analyse. Die Zytokinproduktion (IFNγ und TNFα) durch Schein-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen mit oder ohne Tumorzellinkubation für 4 Stunden wurde durch ELISA gemessen. Mittelwert ± SD, n = 4, zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, ns, nicht signifikant

Wir untersuchten weiter die Wirkung der PD-1-scFv-Sekretion auf CD8+- und CD4+-T-Zellen, die aus der gesamten CAR-T-Zellpopulation gereinigt wurden. Bei den CD8+-T-Zellen zeigten die CD133-CAR-T- und PD-1-CAR-T-Zellen bei allen E:T-Verhältnissen eine größere Zytotoxizität als die CD133-CAR-T-Zellen (P = 0,0490, P = 0,0003 und P = 0,0007). bzw.) (Zusatzdatei 2: Abb. S4B). Bei den CD4 + T-Zellen zeigten die CAR-T-Zellen CD133 CAR-T und PD-1 eine größere Zytotoxizität als die CAR-T-Zellen CD133 bei einem E:T-Verhältnis von 0,25:1 (P = 0,0094) (Zusatzdatei 2). : Abb. S4C), wohingegen bei E:T-Verhältnissen von 1:1 und 0,5:1 (P = 0,9200 bzw. P = 0,8012) keine Unterschiede beobachtet wurden (Zusatzdatei 2: Abb. S4C).

Die Expression von TNFα, IFNγ und CD107a bei einem E:T-Verhältnis von 0,25:1 wurde in vitro überwacht. Die Expression von IFNγ und CD107a sowohl in den CD8+- als auch in den CD4+-T-Zellen von CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen war höher als die von CD133-CAR-T-Zellen (P < 0,0001, P < 0,0001 für CD8 + T-Zellen). ; P = 0,009, P < 0,0001 für CD4 + T-Zellen) (Zusatzdatei 2: Abb. S5A-C). Die Expression von TNFα in den CD8 + T-Zellen von CD133 CAR-T und PD-1 s war höher als die von CD133 CAR-T-Zellen (P = 0,0003) (Zusatzdatei 2: Abb. S5C). Es wurden jedoch keine Unterschiede in der Expression von TNFα zwischen den CD4 + T-Zellen von CD133 CAR-T- und PD-1 s-Zellen und den CD4 + T-Zellen von CD133 CAR-T-Zellen bei Inkubation mit Hpe3B-Zellen gefunden (P = 0,1087). (Zusatzdatei 2: Abb. S5C).

Um zu zeigen, dass umstehende T-Zellen von dem PD-1-blockierenden scFv profitieren können, das von benachbarten CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen abgesondert wird, haben wir zunächst PD-1 mithilfe eines lentiviralen Vektors in gesunde Spender-T-Zellen eingeführt, gefolgt von einer EGFP- und Puromycin-Selektion (Abb. 4A) und erhielt mehr als 97 % PD-1-exprimierende T-Zellen (Abb. 4B). Das Kulturmedium aus CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen wurde konzentriert und 30 Minuten lang mit normalen T-Zellen und PD-1-exprimierenden T-Zellen kokultiviert. Die Analyse der Durchflusszytometrie zeigte, dass sezernierendes PD-1-blockierendes scFv an PD-1 auf PD-1-exprimierenden T-Zellen binden kann, nicht jedoch auf normalen T-Zellen (Abb. 4C). Diese Ergebnisse bestätigten, dass das von CAR-T-Zellen sezernierte PD-1-blockierende scFv an umstehende PD-1 + T-Zellen binden kann. Auch die Immunfluoreszenz bestätigte diese Ergebnisse (Abb. 4D). Um weiter zu zeigen, dass das sekretierte PD-1-blockierende scFv die Funktion von PD-1 + T-Zellen wiederherstellen kann, wurden die PD-1 + T- und Hep3B-Zellen mit oder ohne PD-1-blockierendes scFv inkubiert. Die Granzym-B- und TNFα-Spiegel waren in Gegenwart von PD-1-blockierendem scFv signifikant höher als bei PD-1 + T-Zellen und Hep3B in Abwesenheit von PD-1-blockierendem scFv (P = 0,0006 und P = 0,0094; Abb. 4E–G).

Das von CD133 CAR-T und PD-1 s sezernierte PD-1-blockierende scFv kann umstehende PD-1 + T-Zellen binden und die T-Zellfunktion wiederherstellen. Ein schematisches Diagramm des PD-1-Überexpressions-Lentivirus mit einer GFP-Flagge und einem Puromycin-Selektionsmarker. B Durchflusszytometrie-Analyse der PD-1- und GFP-Expression in T-Zellen oder T-Zellen, die mit einem PD-1-Überexpressions-Lentivirus transfiziert und dann mit Puromycin selektiert wurden. C Durchflusszytometrie-Analysen des sezernierten PD-1, das die scFv-Bindung an normale T-Zellen oder PD-1-T-Zellen blockiert. D Zellulärer Immunfluoreszenztest der Expression von PD-1 (GFP) und PD-1-blockierendem scFv (Anti-c-Myc-tag-647, Rot) auf normalen T-Zellen, PD-1-T-Zellen und mit dem inkubierten PD-1-T-Zellen Kondensierter Überstand von CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen. E Repräsentative durchflusszytometrische Bilder der Granzym B- und TNFα-Expression in PD-1-T-Zellen, mit Hep3B inkubierten PD-1-T-Zellen und mit Hep3B und PD-1-blockierendem scFv inkubierten PD-1-T-Zellen. F, G Quantifizierung der Häufigkeit von Granzym-B/PD-1-T-Zellen und TNFα/PD-1-T-Zellen durch durchflusszytometrische Analyse von PD-1 + T-Zellen, PD-1 + T-Zellen, die mit Hep3B-Zellen inkubiert wurden, und PD-1 + T-Zellen, inkubiert mit Hep3B-Zellen und PD-1-blockierendem scFv, sekretiert von CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen. Mittelwert ± SD, n = 3, zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns, nicht signifikant

Um die In-vivo-Wirksamkeit von CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen zu testen, injizierten wir Hep3B-Krebszellen subkutan in NCG-Mäuse, um Xenotransplantattumoren zu etablieren. CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen, CD133-spezifische CAR-T- und Schein-T-Zellen wurden am Tag 0 und Tag 7 in einer Dosis von 5 Millionen T-Zellen intravenös verabreicht (Abb. 5A). Der BLI der mit CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppe war am 28. Tag viel niedriger als der der mit Mock-T-Zellen behandelten Gruppe (P = 0,0159; Abb. 5B, C). Das mittels BLI gemessene Tumorvolumen der CD133-CAR-T- und PD-1-Zellgruppe war am 21. Tag kleiner als das der mit CD133-spezifischen CAR-T- und Mock-T-Zellen behandelten Gruppen (P = 0,0079 und P = 0,0159). , bzw.; Abb. 5D). Die Überlebensanalyse ergab auch, dass die CD133- und PD1s-CAR-T-Zellen das Überleben der Mäuse im Vergleich zu CD133-CAR-T-Zellen und Schein-T-Zellen signifikant verlängerten (P = 0,0044 bzw. P = 0,0026; Abb. 5E). Um die Anzahl menschlicher T-Zellen in Maus-Xenotransplantat-Tumoren zu bewerten, verwendeten wir die IHC-Färbung von Xenotransplantat-Tumoren mit einem menschlichen CD3-Antikörper. Die CD3-Färbung war bei mit CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Mäusen höher als bei mit CD133-spezifischen CAR-T- und Schein-T-Zellen behandelten Mäusen (Abb. 5F). Um die Anzahl menschlicher T-Zellen in Maus-Xenotransplantat-Tumoren zu ermitteln, führten wir eine IHC-Färbung von Xenotransplantat-Tumoren mit menschlichem CD3-Antikörper durch. Die CD3-gefärbte Fläche bei mit CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Mäusen (4/5) war höher als die bei mit CD133-spezifischen CAR-T-Zellen behandelten (0/5) und mit Mock-T-Zellen behandelten Mäusen (0/5) (Abb. 5F, G). Um die Antitumoreffizienz von CD133- und PD1s-CAR-T-Zellen in einem Metastasierungs-Mausmodell zu bewerten, wurde ein Metastasierungs-Xenotransplantat-Mausmodell durch Injektion von 2,5 Millionen transfizierten Hep3B-luc-Zellen in NCG etabliert Mäuse, bis BLI einen stabilen Tumor zeigte, gefolgt von der Verabreichung einer T-Zelltherapie 55 Tage später (Abb. 6A). Die BLI-basierte Wachstumskurve zeigte, dass die mit CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelte Gruppe eine bessere Antitumorwirkung aufwies als die mit CD133-CAR-T-Zellen und Schein-T-Zellen behandelte Gruppe (P = 0,0260 bzw. P = 0,0087; Abb. 6B, C).

CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen haben in vivo nach intravenöser Injektion eine bessere Antitumorwirkung als CD133-CAR-T-Zellen. Ein schematisches Diagramm der CAR-T-Zellbehandlung und Tumorerkennung. NCG-Mäusen mit Hep3B-Xenotransplantat-Tumoren wurden zwei Dosen von 5 Millionen Schein-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen oder CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen intravenös injiziert, sobald die Hep3B-Xenotransplantat-Tumoren 50–150 mm3 erreichten, wie durch Biolumineszenzbildgebung gezeigt wurde . B Die Tumoren der mit Mock-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppen wurden wöchentlich mittels Biolumineszenzbildgebung überwacht. C Wachstumskurven der mit Schein-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppen in Abb. 5B. D Die Tumorvolumina der mit Mock-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppen wurden durch Biolumineszenzbildgebung gemessen. Mittelwert ± SD, n = 5, zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns, nicht signifikant. E Kaplan-Meier-Überlebenskurven der mit Mock-T-, CD133-CAR-T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppen. **P < 0,01 (Log-Rank-Test); ns, nicht signifikant. F Repräsentative Bilder der HE-, CD133- und CD3-Färbung der mit Mock-T-, CD133-CAR-T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppen. G Prozentsatz der CD3-Expression in Tumoren bei allen Mäusen in Abb. 5F, die zu den mit Mock-T-, CD133-CAR-T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppen gehören

CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen eliminieren Tumorzellen in einem Hep3B-metastasierten und in situ-Xenotransplantat-Tumor-Mausmodell. Ein schematisches Diagramm der CAR-T-Zellbehandlung. Kurz gesagt, NCG-Mäusen wurden 2,5 Millionen Hep3B-luc-Zellen intravenös injiziert. Die Metastasierung wurde durch Biolumineszenzbildgebung bestätigt, und die Gruppen wurden dann 55 Tage nach der Inokulation mit einer Schwanzschleierinjektion von 5 Millionen Mock-T-, CD133-CAR-T- oder CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelt. B Biolumineszenzbildgebung von mit Mock-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen oder CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppen in einem metastasierten HCC-Modell. C Die Wachstumskurven der mit Mock-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppen sind in Abb. 6B dargestellt. Mittelwert ± SD, n = 3, zweiseitiger, ungepaarter Student-t-Test, **P < 0,01, ns, nicht signifikant. D Schematische Darstellung der CAR-T-Zellbehandlung. Kurz gesagt, 2,5 Millionen Hep3B-luc-Zellen wurden in die Leber von NCG-Mäusen injiziert. Der Tumor wurde durch Biolumineszenzbildgebung bestätigt und dann 22 Tage nach der Inokulation mit einer Schwanzschleierinjektion von 5 Millionen Mock T, CD133 CAR-T oder CD133 CAR-T und PD-1 behandelt. E Die Biolumineszenzbildgebung von Gruppen, die mit Schein-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen oder CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelt wurden, in einem situ-Xenotransplantat-Tumormodell von HCC. Mittelwert ± SD, n = 5, zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test, *P < 0,05, ns, nicht signifikant. F, G Der Gesamtfluss und der Metastasierungsfluss der mit Mock-T-Zellen, CD133-CAR-T-Zellen und CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen behandelten Gruppen in Abb. 6E. Mittelwert ± SD, n ≥ 2, zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test, **P < 0,01, ns, nicht signifikant. H Das Balkendiagramm zeigt die Häufigkeit von CAR-T-Zellen 16 Tage nach der letzten Instanz der Mock-T-, CD133-CAR-T- und CD133-CAR-T- und PD-1-Zelltherapie, identifiziert durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Anti-Human-CD3

Um die Antitumorfähigkeit von CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen in einem orthotopen HCC-Mausmodell weiter zu untersuchen, injizierten wir Hep3B-Zellen über eine direkte intrahepatische Injektion in die Leber, um einen In-situ-Xenotransplantat-Tumor zu etablieren, der die natürliche Mikroumgebung der Leber nachahmt und metastasiert HCC. Zweiundzwanzig Tage nach der Tumorinokulation wurden vier Dosen CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen intravenös injiziert (iv), insgesamt 5 × 10^6 CAR-T-Zellen. Der Tumor-BLI zeigte, dass die Antitumorfähigkeit von CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen stärker war als die von Mock-T- oder CD133-CAR-T-Zellen (P = 0,0317 bzw. P = 0,0556, Abb. 6D – G). In der Tumormikroumgebung der CD133-CAR-T- und PD-1-Gruppe wurde ein höherer Prozentsatz menschlicher T-Zellen nachgewiesen als in der Mock-T-Gruppe (P = 0,0571, Abb. 6H).

Geeignete tumorspezifische Antigene sind für die Konzeption und Durchführung einer CAR-T-Immuntherapie unerlässlich. Eine Reihe tumorspezifischer Antigene, wie Glypican 3 (GPC3), epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor Variante III (EGFRvIII), c-Met, PD-L1, CD133, NK-Gruppe-2-Mitglied-D-Liganden (NKG2D) (NKG2DL) und einige Von Viren abgeleitete Krebsantigene wurden erforscht und zur Konstruktion von CAR-T-Zellen gegen HCC verwendet [21,22,23]. Darüber hinaus sind einige Tumorantigen-spezifische CAR-T-Zellen endlich in klinische Studien eingetreten; Fünf klinische Studien untersuchten Glypican-3 und andere weniger konventionelle Ziele, darunter EpCAM, Claudin 18.2, DR5, c-met, EGFRvIII und CD133, wurden ebenfalls untersucht (NCT03013712, NCT03302403, NCT03638206, NCT03941626, NCT02541370). Unter diesen Tumorantigenen weist das zytoplasmatische CD133 Berichten zufolge eine schlechte Prognose bei menschlichen HCC-Patienten auf [24]. Es ist bekannt, dass CD133 auf somatischen Stammzellpopulationen exprimiert wird. Über das hämatopoetische [25] und neuronale [26] System hinaus wird CD133 physiologisch in duktalen Epithelien von Drüsenorganen exprimiert, von denen angenommen wird, dass sie Zellen mit Dedifferenzierungskapazitäten beherbergen [27]. Daher könnte das Targeting von CD133+ auf normale Körperzellen das Risiko potenzieller Nebenwirkungen bergen. Allerdings ist die Expression von CD133, das typischerweise auf CD34-angereicherten normalen Vorläuferzellen des hämatopoetischen Systems vorhanden ist, sehr gering (< 5000 Stellen pro Zelle) [28], und ein humanisiertes Mausmodell wurde verwendet, um die Toxizität von Anti-CD133 zu testen Immuntherapien gegen eine Nische menschlicher hämatopoetischer Stammzellen [29], die zeigten, dass der Anteil CD133-spezifischer CAR-T-Zellen an der Gesamtpopulation von CD34 + hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) minimal ist. Darüber hinaus zeigt CD133 eine begrenzte Färbung in normalen Epithelzellen in duktalen Epithelien [30]. Noch wichtiger ist, dass CD133-gerichtetes CAR-T in einer klinischen Phase-1- und Phase-2-Studie (NCT02541370) (23 Patienten, darunter 14 mit HCC) untersucht wurde, die zeigte, dass die primäre Toxizität aufgrund einer Abnahme des Hämoglobin/Thrombozyten-Verhältnisses ( Grad 3) zeigte eine Selbstheilung innerhalb einer Woche. Das häufigste hochgradige unerwünschte Ereignis war Hyperbilirubinämie. Diese Ergebnisse lieferten vorläufige Beweise dafür, dass CART-133-Zellen bei fortgeschrittenem HCC eine überschaubare Sicherheit aufweisen. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die gesamte CD133-Expression bei männlichen Patienten mit fortgeschrittenem HCC mit einer schlechten Prognose einhergeht, was mit Online-TCGA-Daten übereinstimmt. Unsere Ergebnisse bestätigten außerdem, dass CD133 ein attraktives und sinnvolles Ziel für CAR-T-Zellen bei HCC war.

Nach unserem besten Wissen werden CD133-CAR-T-Zellen normalerweise mithilfe von Lentiviren oder Retroviren konstruiert, was langwierig und teuer ist [16, 31, 32, 33]. Darüber hinaus können virale Vektoren auch potenzielle Nebenwirkungen verursachen, einschließlich potenzieller Karzinogenität, Immunogenität, Entzündungsreaktionen und nachteiliger genomischer Veränderungen [34]. Das SB-Transposonsystem, bestehend aus zwei wesentlichen Komponenten, dem Transposase-Enzym und der Transposon-DNA, ist ein effizientes nichtvirales Gentransferinstrument in Säugetierzellen (35, 36). Die vergleichbare Transfektionswirksamkeit für Zellen, die durch virusbasierten Gentransfer erzeugt wurden, mit den zusätzlichen Vorteilen einer geringeren Immunogenität, verbesserter Sicherheitsprofile, reduzierter Herstellungskomplexität und Vektorbeschaffungskosten, die in früheren Studien berichtet wurden, machen das SB-Transposonsystem zu einem attraktiven System zur Konstruktion von CAR-T Zellen [37,38,39]. CAR-T-Zellen, die auf Basis von SB-Transposons auf CD19 abzielen, sind in klinische Studien eingetreten und zeigten keine schwere Toxizität [40,41,42], aber derzeit berücksichtigt diese Technologie keine inhibitorischen Rezeptoren (wie PD-1) von T-Zellen . In dieser Studie verwendeten wir zum ersten Mal das Sleeping Beauty-System, um PD-1-blockierende scFv CD133-spezifische CAR-T-Zellen gegen HCC zu konstruieren. In Kombination kann die MC-Plattform, die keine bakteriellen Replikationsquellen und keine Antibiotikaresistenzgene aufweist, die SB-Transposition und die Transgenintegration erheblich verbessern, was zu einer höheren Anzahl stabil modifizierter Zielzellen führt [39].

Die Mikroumgebung des Tumors ist eine weitere Herausforderung, die die Wirksamkeit der CAR-T-Zelltherapie beeinflusst. Die Mikroumgebung des Tumors kann inhibitorische Rezeptoren auf T-Zellen induzieren, insbesondere PD-1 [43]. Die Kombination von CAR-T-Zellen und PD-1 scheint vielversprechender. Beispielsweise zeigten auf ICAM1 gerichtete CAR-T-Zellen in Kombination mit einer PD-1-Blockade eine verbesserte Fähigkeit, ICAM1-exprimierende Zieltumorzellen im Vergleich zur alleinigen CAR-T-Behandlung auszurotten [44]. Es wurde über eine Phase-I-Studie zur regionalen Mesothelin-zielgerichteten CAR-T-Zelltherapie in Kombination mit dem Anti-PD-1-Wirkstoff Pembrolizumab bei Patienten mit maligner Pleuraerkrankung berichtet. Die mittlere Gesamtüberlebensrate der Kombinationstherapie betrug 23,9 Monate, während nur CAR- Die T-Therapie dauerte 17,7 Monate [45]. Dennoch kann die systemische Verabreichung einer PD-1-Blockade Nebenwirkungen verursachen, die als immunvermittelte unerwünschte Ereignisse (IRAEs) bezeichnet werden [46]. Daher wurden mehrere Strategien untersucht, um den inhibitorischen Rezeptor PD-1 auf T-Zellen zu blockieren. Zu diesen Strategien gehört die Koexpression eines chimären Schalterrezeptors, bei dem die extrazelluläre Domäne von PD-1 mit Aktivierungssignaldomänen verknüpft ist, und die Comodellierung von CAR-T-Zellen zur Expression eines dominant negativen PD-1-Rezeptors [47], Kotransduktion von CAR-T-Zellen mit Vektoren, die PD-1-zielende shRNAs exprimieren [48] und Verwendung des CRISPR/Cas9-Geneditierungssystems zur Störung von PD-1 auf Glypican- 3 (GPC3)-gerichtete CAR-T-Zellen der zweiten Generation [49]. Allerdings beschränkt sich die Schutzwirkung auf die CAR-T-Zellen selbst. Endogene TILs innerhalb der Tumormikroumgebung unterliegen immer noch einer PD-1-vermittelten Unterdrückung. Angesichts der Tatsache, dass das von CAR-T-Zellen sezernierte PD-1-blockierende scFv in der Lage war, sich an umstehende Zellen zu binden, nehmen wir daher an, dass die lokale Sekretion von CD133-spezifischen CAR-T-Zellen, die in dieser Studie PD-1-blockierende scFv-Zellen sezernieren, schützen könnte endogene Antitumor-Immunzellen und reduzieren das Wachstum von CD133-negativen Tumoren. Obwohl die Verwendung von SB-Plasmiden aus Minikreisen für die Transfektion von T-Zellen zur Konstruktion von CAR-T-Zellen attraktiv war, wurden in unserer Studie nur 8 % der CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen ohne Anreicherung durch c-Myc-Tags erworben Diese Effizienz war ähnlich wie in anderen Studien [39, 50]. Das Anreicherungsverfahren verlängert die Dauer der In-vitro-Kultur, was das Risiko einer Kontamination in der In-vitro-Kultur erhöht und mehr Zeit in Anspruch nimmt, um genügend Zellen für die klinische Anwendung zu gewinnen. Darüber hinaus führte die Länge der In-vitro-Kulturzeit auch zu einer Verringerung oder Abwesenheit von Stammzell-Gedächtnis-T-Zellen (Tscm) oder zentralen Gedächtnis-T-Zellen (TCM), was Berichten zufolge zu einem dauerhaften klinischen Ansprechen auf die CAR-T-Zelltherapie führte [51]. . Daher müssen wir die Transfektion von T-Zellen weiter verbessern, um CAR-T-Zellen basierend auf dem SB-System zu konstruieren. Eine Strategie besteht darin, die In-vivo-Amplifikation zu erforschen, beispielsweise durch den Einsatz von Nanotechnologie zur Realisierung des Aufbaus von CAR-T-Zellen im Blut oder durch den Einsatz von Impfstoffen zur Vermehrung von CAR-T-Zellen in vivo [52,53,54]. In Zukunft könnte die Verbesserung der Amplifikation und Persistenz von CAR-T-Zellen in vivo eine vielversprechende Strategie für CAR-T-Zellen auf Basis von SB-Transposons sein.

Die hier vorgestellte Arbeit unterstützt die Strategie der Verwendung eines SB-basierten nichtviralen genetischen Modifikationssystems mit MC-Transposon-Spendervektoren zur Vereinfachung des aktuellen CAR-T-Zell-Produktionsprotokolls. Diese CAR-T-Zellen können zur Bereitstellung immunmodulatorischer PD-Zellen verwendet werden. 1 scFv innerhalb der Tumormikroumgebung von HCC. Dieser Ansatz könnte möglicherweise das klinische Ergebnis als Reaktion auf die CAR-T-Zelltherapie verbessern und die Sicherheit der Checkpoint-Blockade-Therapie erhöhen.

Die meisten aktuellen Studien testeten menschliche CAR-T-Zellen in immundefizienten Tieren, typischerweise NOD Scid Gamma (NSG)-Mäusen, denen menschliche Tumoren transplantiert wurden. Die Verwendung von NSG-Mäusen als Empfänger menschlicher Xenotransplantate ermöglicht das Wachstum fast aller Arten primärer menschlicher Tumoren in vivo, einschließlich der meisten soliden Tumoren und hämatologischen Malignome, die die Eigenschaften des Primärtumors im Patienten beibehalten. Darüber hinaus kann die Behandlung von NSG-Tieren, die menschliche Tumoren tragen, mit CAR-T-Zellen verwendet werden, um die Antitumorwirksamkeit von CAR-T-Zellen und die Fähigkeit dieser Zellen zu analysieren, sich im Blut und in den Tumoren behandelter Tiere einzupflanzen und dort zu persistieren [55]. . Die Verwendung dieser Tiere weist jedoch noch einige Einschränkungen auf: (1) Die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen CAR-T-Zellen und dem angeborenen System des Menschen ist schwierig, (2) NSG-Tiere bilden die immunsuppressive Tumormikroumgebung in Tumor-Xenotransplantaten nicht nach und (3 ) NSG-Mäuse können die schwere Toxizität, die in einigen klinischen Studien zum Testen von CAR-T-Zellen beobachtet wurde, nicht reproduzieren. Dennoch hat sich das NSG-Modell trotz dieser Einschränkungen als nützlich für die weitere Bewertung der direkten abtötenden Wirkung von CAR-T-Zellen auf Tumoren erwiesen. Eine weitere Einschränkung dieser Studie ist die ungleiche Geschlechtergröße in der Kohorte. Diese Ungleichheit ist eine Folge der höheren Prävalenz von Leberkrebs bei Männern. Folglich war die Anzahl der für die Analyse verfügbaren weiblichen Patienten auf nur 6 von 67 Patienten begrenzt. Aufgrund der begrenzten Anzahl weiblicher Patienten konnten wir in unserer Analyse keine unmittelbaren Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Patienten feststellen. Wir sind uns jedoch bewusst, dass dieses Ungleichgewicht zwischen den Geschlechtern möglicherweise die Studienergebnisse und Schlussfolgerungen beeinflussen könnte. Um diese Einschränkung zu beseitigen und ein tieferes Verständnis der CD133-Expression und ihrer prognostischen Auswirkungen bei Leberkrebs zu erlangen, sind weitere Untersuchungen mit einer größeren und ausgewogenen Geschlechterkohorte unerlässlich.

In dieser Studie fanden wir heraus, dass die CD133-Expression bei männlichen Patienten im Spätstadium (II und III) signifikant mit einem schlechteren PFS und OS verbunden war. Darüber hinaus weisen Patienten mit fortgeschrittenem HCC im Vergleich zu Patienten mit HCC im Frühstadium eine höhere PD-L1-Expression auf, was das CD133-Protein zu einem sinnvollen Ziel in der CAR-T-Zelltherapie für männliche Patienten mit fortgeschrittenem HCC macht, und diese Patienten könnten auch von PD-L1 profitieren. 1/PD-L1-Checkpoint-Blockade-Therapie. Daher haben wir eine nichtvirale Methode verwendet, um erfolgreich CD133-spezifische CAR-T-Zellen zu konstruieren, die PD-1-scFv-Checkpoint-Blockade-Inhibitoren basierend auf einem SB-System aus Minicircle-Vektoren sezernieren können, das eine geringere Immunogenität aufweist, geringere Kosten verursacht und im Vergleich deutlich sicherer ist mit viralen Vektoren. Wir haben die Wirkung der Behandlung mit CD133 CAR-T- und PD-1-Zellen in vitro und in vivo weiter bestätigt. Insgesamt deuten unsere präklinischen Ergebnisse darauf hin, dass CD133-CAR-T- und PD-1-Zellen eine therapeutisch anwendbare Strategie für männliche Patienten mit fortgeschrittenem HCC und hoher CD133-Expression sein könnten.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Rinderwachstumshormon

Biolumineszenz-Bildgebung

Chimäres Antigenrezeptor-spezifisches T

CD133-spezifische CAR-T-Zellen, die PD-1 sezernieren und scFv blockieren

Kombinierte positive Bewertung

Krebsstammzellen

Effektor zum Ziel

Variante III des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors

Glypican 3

Hepatozelluläres Karzinom

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Intravenöse Injektion

Immunbedingte unerwünschte Ereignisse

Invertierte Terminalwiederholungen

Minicircle

NK-Gruppe 2 606 Mitglieds-D-Liganden (NKG2D).

NOD Scid Gamma

Gesamtüberleben

Programmiertes Zelltodprotein 1

Progressionsfreies Überleben

Dornröschen

Einkettiges variables Fragment

Zentrale Gedächtnis-T-Zellen

Stammzellgedächtnis-T-Zellen

Posttranskriptionelles regulatorisches Element des Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus

Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Globale Krebsstatistik 2020: GLOBOCAN schätzt die Inzidenz und Mortalität weltweit für 36 Krebsarten in 185 Ländern. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209–49.

Artikel PubMed Google Scholar

Colagrande S, Inghilesi AL, Aburas S, Taliani GG, Nardi C, Marra F. Herausforderungen des fortgeschrittenen hepatozellulären Karzinoms. Welt J Gastroenterol. 2016;22(34):7645–59.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu AX, Finn RS, Edeline J, Cattan S, Ogasawara S, Palmer D, et al. Pembrolizumab bei Patienten mit fortgeschrittenem hepatozellulärem Karzinom, die zuvor mit Sorafenib behandelt wurden (KEYNOTE-224): eine nicht randomisierte, offene Phase-2-Studie. Lancet Oncol. 2018;19(7):940–52.

Artikel PubMed Google Scholar

El-Khoueiry AB, Sangro B, Yau T, Crocenzi TS, Kudo M, Hsu C, et al. Nivolumab bei Patienten mit fortgeschrittenem hepatozellulärem Karzinom (CheckMate 040): eine offene, nicht vergleichende Phase-1/2-Dosiseskalations- und Erweiterungsstudie. Lancet (London, England). 2017;389(10088):2492–502.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakano S, Eso Y, Okada H, Takai A, Takahashi K, Seno H. Jüngste Fortschritte in der Immuntherapie bei hepatozellulärem Karzinom. Krebserkrankungen (Basel). 2020;12(4):775.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou HM, Zhang JG, Zhang Signaltransduktionsziel Ther. 2021;6(1):62.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Frank NY, Schatton T, Frank MH. Das therapeutische Versprechen des Krebsstammzellkonzepts. J Clin Invest. 2010;120(1):41–50.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suetsugu A, Nagaki M, Aoki H, Motohashi T, Kunisada T, Moriwaki H. Charakterisierung von CD133+ hepatozellulären Karzinomzellen als Krebsstamm-/Vorläuferzellen. Biochem Biophys Res Commun. 2006;351(4):820–4.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang XR, Xu Y, Yu B, Zhou J, Qiu SJ, Shi GM, et al. Hohe Expressionsniveaus mutmaßlicher hepatischer Stamm-/Vorläuferzell-Biomarker im Zusammenhang mit der Tumorangiogenese und einer schlechten Prognose des hepatozellulären Karzinoms. Darm. 2010;59(7):953–62.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kohga K, Tatsumi T, Takehara T, Tsunematsu H, Shimizu S, Yamamoto M, et al. Die Expression von CD133 verleiht malignes Potenzial durch die Regulierung von Metalloproteinasen beim menschlichen hepatozellulären Karzinom. J Hepatol. 2010;52(6):872–9.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cavazza A, Moiani A, Mavilio F. Mechanismen der retroviralen Integration und Mutagenese. Hum Gene Ther. 2013;24(2):119–31.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nayak S, Herzog RW. Fortschritte und Aussichten: Immunantworten auf virale Vektoren. Gene Ther. 2010;17(3):295–304.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Aronovich EL, McIvor RS, Hackett PB. Das Dornröschen-Transposonsystem: ein nicht-viraler Vektor für die Gentherapie. Hum Mol Genet. 2011;20(R1):R14-20.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chabot S, Orio J, Schmeer M, Schleef M, Golzio M, Teissie J. Minicircle DNA-Elektrotransfer für eine effiziente gewebespezifische Genabgabe. Gene Ther. 2013;20(1):62–8.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kobelt D, Schleef M, Schmeer M, Aumann J, Schlag PM, Walther W. Leistung hochwertiger Minicircle-DNA für den In-vitro- und In-vivo-Gentransfer. Mol Biotechnol. 2013;53(1):80–9.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang Y, Chen M, Wu Z, Tong C, Dai H, Guo Y, et al. CD133-gerichtete CAR-T-Zellen für fortgeschrittene maligne Metastasen: eine Phase-I-Studie. Onkoimmunologie. 2018;7(7): e1440169.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Cui Z, Geurts AM, Liu G, Kaufman CD, Hackett PB. Struktur-Funktions-Analyse der invertierten terminalen Wiederholungen des Dornröschen-Transposons. J Mol Biol. 2002;318(5):1221–35.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Janjigian YY, Shitara K, Moehler M, Garrido M, Salman P, Shen L, et al. Erstlinien-Nivolumab plus Chemotherapie versus Chemotherapie allein bei fortgeschrittenem Magenkarzinom, gastroösophagealem Übergang und ösophagealem Adenokarzinom (CheckMate 649): eine randomisierte, offene Phase-3-Studie. Lancet (London, England). 2021;398(10294):27–40.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cortes J, Cescon DW, Rugo HS, Nowecki Z, Im SA, Yusof MM, et al. Pembrolizumab plus Chemotherapie versus Placebo plus Chemotherapie bei zuvor unbehandeltem lokal rezidivierendem inoperablem oder metastasiertem dreifach negativem Brustkrebs (KEYNOTE-355): eine randomisierte, placebokontrollierte, doppelblinde klinische Phase-3-Studie. Lancet (London, England). 2020;396(10265):1817–28.

Artikel PubMed Google Scholar

Nakajima M, Sakoda Y, Adachi K, Nagano H, Tamada K. Verbessertes Überleben von chimären Antigenrezeptor-konstruierten T-Zellen (CAR-T) und tumorspezifischen T-Zellen, verursacht durch das einkettige variable Fragment des antiprogrammierten Zelltodproteins 1. Produktion von CAR-T-Zellen. Krebswissenschaft. 2019;110(10):3079–88.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiang W, Li T, Guo J, Wang J, Jia L, Shi X, et al. Bispezifische c-Met/PD-L1-CAR-T-Zellen haben eine verstärkte therapeutische Wirkung bei hepatozellulärem Karzinom. Front Oncol. 2021;11:546586.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun L, Gao F, Gao Z, Ao L, Li N, Ma S, et al. Verursacht eine Antigen-induzierte Blockierungswirkung auf CAR-T-Zellen, die auf Glypican-3 bei hepatozellulärem Karzinom abzielen. J Immuner Krebs. 2021;9(4):e001875.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun B, Yang D, Dai H, Liu X, Jia R. Eradikation des hepatozellulären Karzinoms durch NKG2D-basierte CAR-T-Zellen. Krebsimmunol Res. 2019;7(11):1813–23.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Glumac PM, LeBeau AM. Die Rolle von CD133 bei Krebs: eine kurze Übersicht. Clin Transl Med. 2018;7(1):18.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yin AH, Miraglia S, Zanjani ED, Almeida-Porada G, Ogawa M, Leary AG, et al. AC133, ein neuartiger Marker für menschliche hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen. Blut. 1997;90(12):5002–12.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Uchida N, Buck DW, He D, Reitsma MJ, Masek M, Phan TV, et al. Direkte Isolierung menschlicher Stammzellen des Zentralnervensystems. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97(26):14720–5.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corbeil D, Fargeas CA, Jaszai J. CD133 könnte ein Pan-Marker für Epithelzellen mit Dedifferenzierungskapazität sein. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111(15):E1451–2.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Orden K, Birse C, He T, Smith L, McKinnon K, Lee C, et al. Die Proteomanalyse kolorektaler Tumorzellen identifiziert CD133/Prominin-1, einen Krebsstammzellmarker, als therapeutischen Kandidaten für monoklonale Antikörper. Krebs Res. 2007;67(9_Supplement):1324.

Google Scholar

Vora P, Venugopal C, Salim SK, Tatari N, Bakhshinyan D, Singh M, et al. Die rationale Entwicklung CD133-zielender Immuntherapien für Glioblastome. Zellstammzelle. 2020;26(6):832-44 e6.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Smith LM, Nesterova A, Ryan MC, Duniho S, Jonas M, Anderson M, et al. CD133/Prominin-1 ist ein potenzielles therapeutisches Ziel für Antikörper-Wirkstoff-Konjugate bei Leberzell- und Magenkrebs. Br J Krebs. 2008;99(1):100–9.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu Oncotarget. 2015;6(1):171–84.

Artikel PubMed Google Scholar

Vora P, Venugopal C, Salim SK, Tatari N, Bakhshinyan D, Singh M, et al. Die rationale Entwicklung CD133-zielender Immuntherapien für Glioblastome. Zellstammzelle. 2020;26(6):832-44.e6.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Han Y, Sun B, Cai H, Xuan Y. Gleichzeitige Bekämpfung normaler und stammzellähnlicher Magenkrebszellen mittels Cisplatin- und Anti-CD133-CAR-T-Kombinationstherapie. Krebsimmunol Immunother. 2021;70(10):2795–803.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shirley JL, de Jong YP, Terhorst C, Herzog RW. Immunantworten auf virale Gentherapievektoren. Mol Ther. 2020;28(3):709–22.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ivics Z, Izsvák Z. Dornröschentransposition. Mikrobiol-Spektr. 2015;3(2):Mdna3-0042–2014.

Artikel PubMed Google Scholar

Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, Izsvák Z. Molekulare Rekonstruktion von Dornröschen, einem Tc1-ähnlichen Transposon aus Fisch, und seine Transposition in menschlichen Zellen. Zelle. 1997;91(4):501–10.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Field AC, Vink C, Gabriel R, Al-Subki R, Schmidt M, Goulden N, et al. Vergleich des lentiviralen und Dornröschen-vermittelten Alphabeta-T-Zellrezeptor-Gentransfers. Plus eins. 2013;8(6):e68201.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Izsvak Z, Hackett PB, Cooper LJ, Ivics Z. Umsetzung der Dornröschen-Transposition in Zelltherapien: Siege und Herausforderungen. BioEssays. 2010;32(9):756–67.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monjezi R, Miskey C, Gogishvili T, Schleef M, Schmeer M, Einsele H, et al. Verbessertes CAR-T-Zell-Engineering unter Verwendung nicht-viraler Sleeping Beauty-Transposition aus Minicircle-Vektoren. Leukämie. 2017;31(1):186–94.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Magnani CF, Gaipa G, Lussana F, Belotti D, Gritti G, Napolitano S, et al. Von Sleeping Beauty entwickelte CAR-T-Zellen erzielen eine antileukämische Aktivität ohne schwerwiegende Toxizitäten. J Clin Invest. 2020;130(11):6021–33.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Singh H, Srour SA, Milton DR, McCarty J, Dai C, Gaballa MR, et al. Dornröschen entwickelte eine CD19-CAR-T-Zelltherapie für fortgeschrittene hämatologische B-Zell-Malignome. Frontimmunol. 2022;13:1032397.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tipanee J, Samara-Kuko E, Gevaert T, Chuah MK, VandenDriessche T. Universelle allogene CAR-T-Zellen, entwickelt mit Sleeping Beauty-Transposons und CRISPR-CAS9 für die Krebsimmuntherapie. Mol Ther. 2022;30(10):3155–75.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sharpe AH, Pauken KE. Die vielfältigen Funktionen des PD1-Hemmwegs. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–67.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gray KD, McCloskey JE, Vedvyas Y. Die PD1-Blockade verbessert die therapeutische Wirksamkeit von ICAM1-gesteuertem CAR T bei fortgeschrittenem Schilddrüsenkrebs. Clin Cancer Res. 2020;26(22):6003–16.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adusumilli PS, Zauderer MG. Eine Phase-I-Studie zur regionalen Mesothelin-zielgerichteten CAR-T-Zelltherapie bei Patienten mit maligner Pleuraerkrankung in Kombination mit dem Anti-PD-1-Wirkstoff Pembrolizumab. Krebsentdeckung. 2021;11(11):2748–63.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Michot JM, Bigenwald C, Champiat S, Collins M, Carbonnel F, Postel-Vinay S, et al. Immunbedingte unerwünschte Ereignisse mit Immun-Checkpoint-Blockade: eine umfassende Übersicht. Eur J Krebs. 2016;54:139–48.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu X, Ranganathan R, Jiang S, Fang C, Sun J, Kim S, et al. Ein chimärer Schalterrezeptor, der auf PD1 abzielt, erhöht die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen der zweiten Generation bei fortgeschrittenen soliden Tumoren. Kann Res. 2016;76(6):1578–90.

Artikel CAS Google Scholar

Liu G, Zhang Q, Li D, Zhang L, Gu Z, Liu J, et al. Die Stummschaltung von PD-1 verbessert die Antitumoraktivitäten menschlicher, auf Mesothelin gerichteter CAR-T-Zellen. Hum Immunol. 2021;82(2):130–8.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Guo X, Jiang H, Shi B, Zhou M, Zhang H, Shi Z, et al. Die Störung von PD-1 verstärkte die Antitumoraktivität chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen gegen hepatozelluläres Karzinom. Front Pharmacol. 2018;9:1118.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Querques I, Mades A, Zuliani C. Eine hochlösliche Sleeping Beauty-Transposase verbessert die Kontrolle der Geninsertion. Nat Biotechnol. 2019;37(12):1502–12.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meyran D, Zhu JJ, Butler J, Tantalo D, MacDonald S, Nguyen TN, et al. T(STEM)-ähnliche CAR-T-Zellen zeigen in präklinischen Modellen eine verbesserte Persistenz und Tumorkontrolle im Vergleich zu herkömmlichen CAR-T-Zellen. Sci Transl Med. 2023;15(690):eabk1900.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Smith TT, Stephan SB, Moffett HF, McKnight LE, Ji W, Reiman D, et al. In-situ-Programmierung leukämiespezifischer T-Zellen mithilfe synthetischer DNA-Nanoträger. Nat Nanotechnologie. 2017;12(8):813–20.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reinhard K, Rengstl B, Oehm P, Michel K, Billmeier A, Hayduk N, et al. Ein RNA-Impfstoff fördert die Ausbreitung und Wirksamkeit von Claudin-CAR-T-Zellen gegen solide Tumoren. Wissenschaft (New York, NY). 2020;367(6476):446–53.

Artikel CAS Google Scholar

Ma L, Dichwalkar T, Chang JYH, Cossette B, Garafola D, Zhang AQ, et al. Erhöhte CAR-T-Zellaktivität gegen solide Tumoren durch Impfstoffverstärkung durch den chimären Rezeptor. Wissenschaft (New York, NY). 2019;365(6449):162–8.

Artikel CAS Google Scholar

Shultz LD, Goodwin N, Ishikawa F, Hosur V, Lyons BL, Greiner DL. Wachstum und Therapie von menschlichem Krebs in immundefizienten Mausmodellen. Cold Spring Harb Protokoll. 2014;2014(7):694–708.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

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Wir danken den Mitarbeitern der Abteilung für Biotherapie am Sun Yat-Sen University Cancer Center für die routinemäßige Wartung im Labor.

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation Youth Foundation of China (Grant-Nr. 81901764 und 81803079) und der China Postdoctoral Science Foundation (Grant-Nr. 2019M663302) unterstützt.

Chaopin Yang, Jinqi You, Qiuzhong Pan und Yan Tang haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für experimentelle Forschung, Staatliches Schlüssellabor für Onkologie in Südchina, Kollaboratives Innovationszentrum für Krebsmedizin, Krebszentrum der Sun Yat-Sen-Universität, Guangzhou, Guangdong, 510060, Volksrepublik China

Chaopin Yang, Jinqi You, Qiuzhong Pan, Yan Tang, Yue Huang, Jiamei Gu, Yizhi Wang, Xinyi Yang, Yufei Du, Dijun Ouyang, Hao Chen, Haoran Zhong, Yongqiang Li, Jieying Yang, Yulong Han, Fengze Sun, Yuanyuan Chen , Qijing Wang, Desheng Weng, Tong Xiang und Jianchuan Xia

Abteilung für Biotherapie, Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, Guangdong, 510060, Volksrepublik China

Chaopin Yang, Jinqi You, Qiuzhong Pan, Yan Tang, Yue Huang, Xinyi Yang, Yufei Du, Dijun Ouyang, Hao Chen, Yongqiang Li, Jieying Yang, Yulong Han, Fengze Sun, Yuanyuan Chen, Qijing Wang, Desheng Weng, Tong Xiang &Jianchuan Xia

Internationales Institut für translationale chinesische Medizin, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong, 510060, Volksrepublik China

Liming Cai & Zhongqiu Liu

Abteilung für Molekulardiagnostik, Sun Yat-Sen-Universität, Krebszentrum, Guangzhou, Guangdong, 510060, Volksrepublik China

Jiamei Gu

Abteilung für Thoraxchirurgie, Krebszentrum der Sun Yat-Sen-Universität, Guangzhou, Guangdong, 510060, Volksrepublik China

Yizhi Wang

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JCX, TX, ZQL, QZP und CPY haben die Studie konzipiert. CPY und TX haben den Artikel geschrieben. CPY und JQY führten den Großteil der Experimente durch. CPY, QZP und YH haben die in dieser Studie verwendeten Plasmide entworfen. JMG, YQL und QJW nahmen an den Transfektionsexperimenten teil. YT, LMC, HRZ, HC, YZW und XYY halfen bei den Tierversuchen. JYY, YLH, YT, FZS und YYC halfen bei einigen molekularen Experimenten. YFD, DJOY und JQY halfen bei den Überlebensanalysen. DSW hat in dieser Studie einige Vorschläge gemacht. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Zhongqiu Liu, Tong Xiang oder Jianchuan Xia.

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission für Humanforschung (Genehmigungsnummer GZR2019-287) und der Ethikkommission für Versuchstiere des Sun Yat-sen University Cancer Center (Genehmigungsnummer 18080B) genehmigt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Die Sequenz von pSB-EF1alpha-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-P2A-PD-1 blockiert scFv-WPRE-BGH polyA.

Korrelation zwischen CD133-Expression und klinischen Merkmalen bei HCC. Tabelle S2. Korrelationen zwischen klinischen Merkmalen und Patientenprognose. Tabelle S3. Univariate und multivariate Analysen klinischer Variablen im Zusammenhang mit PFS bei männlichen Patienten. Tabelle S4. Univariate und multivariate Analysen klinischer Variablen im Zusammenhang mit dem OS bei männlichen Patienten. Abbildung S1. Überlebensanalysen mit unterschiedlichen Auswertungsmethoden. Abbildung S2. Zelllebensfähigkeit und CAR-Expression nach Transfektion mit Transposon- und Transposase-Vektoren im Verhältnis 3:1 in T-Zellen aus PBMCs. Abbildung S3. Treg-Phänotyp (CD4+CD25+Foxp3) von CD4-positiven CAR-T-Zellen. Abbildung S4. Spezifische zytotoxische Wirkungen von CD133 CAR-T- und PD-1s-Zellen gegen CD133+ HCC-Zelllinien. Abbildung S5. Verstärkte spezifische zytotoxische Wirkungen von CD133 CAR-T- und PD-1s-Zellen unter CD8- oder CD4-positiven CAR-T-Zellen gegenüber CD133+ HCC-Zelllinien.

Bilder der ursprünglichen, unbeschnittenen Gele/Blots in Abb. 2 B, F und Abb. 3B.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, C., You, J., Pan, Q. et al. Die gezielte Abgabe eines PD-1-blockierenden scFv durch CD133-spezifische CAR-T-Zellen mittels nichtviraler Sleeping Beauty-Transposition zeigt eine verbesserte Antitumorwirksamkeit bei fortgeschrittenem hepatozellulärem Karzinom. BMC Med 21, 327 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-03016-0

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Eingegangen: 12. Juni 2022

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-03016-0

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