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Aug 09, 2023

Herausforderungen und Lösungen beim PCR-Assay-Design

Bildnachweis: Sebastian Condrea / Getty Images Das Entwerfen reproduzierbarer PCR-Assays erfordert die Optimierung mehrerer beweglicher Ziele, von der Standardisierung jeder Komponente in manchmal winzigen Reaktionsvolumina bis hin zu

Bildnachweis: Sebastian Condrea / Getty Images

Die Entwicklung reproduzierbarer PCR-Assays erfordert die Optimierung mehrerer beweglicher Ziele, von der Standardisierung jeder Komponente in manchmal winzigen Reaktionsvolumina bis hin zur Vorausplanung, um eine langfristige und sichere Lagerung von Reagenzien, Proben und PCR-Produkten sicherzustellen.

Das Verständnis der Feinheiten und allgemeinen Herausforderungen bei der Entwicklung und Optimierung PCR-basierter Diagnosetests wird Forschern dabei helfen, solche Hindernisse mithilfe der neuesten verfügbaren Lösungen zu überwinden. Hier diskutieren wir einige der häufigsten Herausforderungen, denen Forscher bei der Entwicklung eines PCR-basierten molekulardiagnostischen Tests begegnen können, sowie einige mögliche Lösungen.

Eine der ersten Herausforderungen beim Entwurf einer PCR-Reaktion ist die Auswahl der optimalen Polymerase für die Anwendung. Die Abwägung Ihrer Anforderungen im Zusammenhang mit den Eigenschaften der biologischen Probe, der Länge der zu amplifizierenden Sequenz und der gewünschten Sequenzgenauigkeit des amplifizierten Produkts ist von entscheidender Bedeutung.

Gerald Hunter, PhD, Feldanwendungswissenschaftler bei Fortis Life Sciences, der über umfassende Erfahrung in der Optimierung von PCR-Assays verfügt, sagt: „Verschiedene DNA-Polymerasen haben unterschiedliche Spezifitäten, enzymatische Funktionen, Fehlerraten (Fidelitäten) und Toleranz gegenüber PCR-Inhibitoren.“

Die nächsten Herausforderungen bestehen darin, Primer zu entwerfen, die bei einer gewünschten Temperatur mit hoher Spezifität an DNA-Vorlagen anlagern, und die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches zu optimieren.

„Der Erfolg bei der PCR basiert auf der Fähigkeit Ihrer Reaktion, ein niedriges Verhältnis unspezifischer Primerbindung aufrechtzuerhalten, und daher wird die Annealing-Temperatur zu einem kritischen Faktor, der optimiert werden muss“, sagt Hunter. „Darüber hinaus müssen die PCR-Pufferkomponenten – pH-Wert, Salz, Mg2+, Primer und Enzymkonzentration, die alle einen Einfluss auf die Leistung der Reaktion haben – berücksichtigt werden und möglicherweise optimiert werden.“

Eine unspezifische Amplifikation tritt im Allgemeinen auf, wenn Primer an Sequenzen binden, für die sie nicht entwickelt wurden. Dies führt zu unbeabsichtigten Produkten.

„Grundlagendesign ist sowohl eine Kunst als auch eine Wissenschaft. Wichtig ist nicht nur die richtige Primerkonzentration, sondern auch die richtige Primersequenz“, sagt Hunter. „Glücklicherweise gibt es viele kostenlose Online-Primerdesign-Softwaretools, die für das PCR-Primerdesign verwendet werden können. Seien Sie jedoch nicht überrascht, wenn Sie eine Handvoll Primerpaarsätze testen müssen, bevor Sie die richtige Kombination finden.“

Eine Möglichkeit, unspezifische Amplifikation zu vermeiden, besteht darin, Ihr Reaktionsgemisch auf Eis vorzubereiten, bis Sie bereit sind, Ihr PCR-Röhrchen oder Ihren PCR-Streifen in den Thermocycler einzuführen. Die niedrige Temperatur verringert die Aktivität der DNA-Polymerase und verringert die Wahrscheinlichkeit einer ungenauen Bindung der Primer. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahme können dennoch unerwünschte Produkte synthetisiert werden.

Eine weitere Lösung, um unspezifischer Amplifikation entgegenzuwirken, ist die Verwendung einer Hot-Start-DNA-Polymerase. Die Hot-Start-DNA-Polymerase wird chemisch so modifiziert, dass sie bei Raumtemperatur inaktiv ist und eine unspezifische Amplifikation verhindert. Nukleotide werden durch das modifizierte Enzym erst dann aneinandergereiht, wenn ein Hitzeaktivierungsschritt erfolgt ist. Dies ermöglicht den Aufbau der PCR-Reaktion bei Raumtemperatur, ohne dass die Möglichkeit von Störprodukten und die Bildung von Primer-Dimeren besteht. Ein zusätzlicher Vorteil der Hot-Start-PCR besteht darin, dass Reaktionszyklusbedingungen ohne Hitzeaktivierung als Negativkontrolle verwendet werden können.

Multiplexing ist die Fähigkeit, eine Reihe von Bedingungen oder Faktoren in einem einzigen Test zu erkennen, anstatt für jeden Parameter einzelne Tests durchzuführen.1 Es verbessert den Durchsatz, senkt die Kosten für Tests und verbessert die Effizienz der Patientenversorgung.

Multiplexing wird oft durch das Primer-Design erschwert. Primer für Multiplex-PCRs müssen für die Zielsequenzierung hochselektiv sein und konstante Schmelztemperaturen aufweisen, die Amplikons einheitlicher Länge erzeugen. Dies erfordert sorgfältige Berechnungen beim Entwurf von Primern. Bei unsachgemäßem Design bilden Primer Homo- oder Hetero-Dimere oder verstärken Off-Target-Sequenzen.

„Multiplex-PCR erfordert typischerweise ein zusätzliches Oligo, eine sogenannte Sonde. Um zwei oder mehr Tests zu multiplexen, müssen diese Sonden voneinander unterscheidbar und gleichzeitig nachweisbar sein“, sagt Hunter.

Lösungen für das Multiplexing umfassen die Verwendung von Hot-Start-Polymerasen und Primer-Design-Algorithmen. Die Algorithmen begrenzen die Primerdimerisierung aufgrund der Komplementarität und die Amplifikation außerhalb des Ziels durch Sequenzspezifität.

Hunter fügt hinzu: „Die verwendeten Primer-Designalgorithmen müssen die Sequenzspezifität berücksichtigen und sowohl Off-Target- als auch Primer-Dimer-Effekte begrenzen, und die zur Amplifikation verwendete DNA-Polymerase muss streng im Heißstart modifiziert werden, um sicherzustellen, dass alle Primer vollständig geschmolzen und spezifisch sind.“ an ihre Zielsequenz angelagert, bevor die Polymerase aktiv wird. Im Idealfall ist diese Polymerase für schnelle Thermocycling-Bedingungen geeignet und weist bei Umgebungstemperaturen eine äußerst geringe Hintergrundaktivität auf.“

Umwelt- und Gewebeproben wie Boden und Speichel enthalten häufig Komponenten, die PCR-Reaktionen durch Bindung an Polymerasen, Enzym-Cofaktoren, genomische DNA oder amplifizierte einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA hemmen. Verunreinigungen können die DNA-Isolierung, die Polymeraseaktivität sowie die analytische und diagnostische Empfindlichkeit verringern.

Beispielsweise werden PCR-Inhibitoren häufig in Stuhlproben gefunden. Diese können aus Nahrungsbestandteilen stammen und zu falsch negativen PCR-Ergebnissen führen. Darüber hinaus können auch Häm in Blutproben und Kollagen in Gewebeproben die PCR hemmen. Die Zugabe von BSA (Rinderserumalbumin) zum Reaktions-Mastermix und die Verwendung hemmungsresistenter Polymerasen sind wirksame Methoden zur Beseitigung der Hemmwirkung dieser Verbindungen.2

Die PCR ist empfindlich genug, um eine einzelne Genkopie aus einer einzelnen Zelle nachzuweisen. Diese extreme Empfindlichkeit stellt ein Problem dar, da damit auch kontaminierende Spuren von DNA oder RNA-Fragmenten aus einer früheren Reaktion oder Fremdquellen erkannt werden können.

„Viele Labore erwägen jetzt den Einsatz von Uracil-DNA-Glykosylasen (UDGs) in ihren PCR-Arbeitsabläufen, um eine Verschleppungskontamination zu verhindern“, sagt Hunter.

UDGs sind hochkonservierte DNA-Reparaturenzyme. Seine Funktion besteht darin, Uracil aus der DNA zu entfernen. Uracil kommt normalerweise in RNA und nicht in DNA vor. Wenn UDGs und dUTPs zur PCR-Reaktion hinzugefügt werden, können UDGs DNA aus früheren PCR-Reaktionen, die dUTP anstelle von dTTP enthielten, selektiv abbauen. Dieser Schritt erfolgt bei 37 °C vor der Hotstart-Aktivierung der Polymerase. Das Vorhandensein von Uracil anstelle von Thymin hat keinen Einfluss auf die elektrophoretische Mobilität oder Sequenzierung der PCR-Produkte und die Aktivität UDG wird während der Hot-Start-Aktivierung zerstört.

„Ein weiterer Tipp wäre die Verwendung inhibitortoleranter PCR-Mastermixe für schwierige oder schmutzige Probentypen“, sagt Hunter.

Wenn die Zeit von entscheidender Bedeutung ist, beispielsweise wenn virale RNA nachgewiesen werden muss, um Infektionen zu bestätigen, kann der zweistufige Prozess der reversen Transkription gefolgt von der Amplifikation zu einer einstufigen RT-qPCR komprimiert werden. Dadurch können beide Reaktionen in einem einzigen Röhrchen in einem einzigen Schritt durchgeführt werden, was das Risiko einer Kontamination verringert und den Zeitaufwand für die Durchführung verringert.

Darüber hinaus kann die langsame Reaktionskinetik bei Endpunkt-PCRs und qPCRs zu einem Arbeitsablauf führen, der Stunden dauert. Fortschritte bei qPCR-Farbstoffen, Sonden und Thermocycling-Technologien, wie schnellere Heiz- und Kühlmechanismen, sowie Fortschritte bei Polymerase und Puffern haben die Gesamtzeit für die PCR erheblich verkürzt und die molekulare Diagnostik am POC (Point of Care) möglich gemacht.

PCR-Produkte und Reagenzien werden normalerweise auf Trockeneis transportiert, es besteht jedoch die Gefahr, dass das Trockeneis verdunstet, bevor die Pakete ihren Bestimmungsort erreichen. Die langfristige Lagerung von Nukleinsäureproben, PCR-Reagenzien und amplifizierten Produkten bei Umgebungstemperatur wird vorzugsweise durch Lyophilisierungs- und Lufttrocknungslösungen erreicht, die eine Lagerung in Trockeneis während des Transports und eine Kühllagerung im Labor ausschließen.

„Wir sehen, dass viele Point-of-Care-Unternehmen ihren Einsatz der Lyophilisierung, insbesondere lyophilisierter Perlen, für Enzyme und PCR-Mastermixe ausweiten. Lyophilisierte Perlen sind zuverlässiger, einfacher zu handhaben, erfordern keine Aliquotierung und können bei Umgebungstemperatur verwendet und gelagert werden, was sie ideal für Point-of-Care-Umgebungen macht“, sagt Hunter.

Lyophilisierung, Gefriertrocknung oder Sublimation bieten eine alternative Lösung für eine langfristige Haltbarkeit bei Umgebungstemperaturen, indem dem Produkt Wasser entzogen wird, ohne das Produkt übermäßig zu erhitzen. Der Prozess umfasst das Einfrieren und Platzieren des Produkts in einem Vakuum und kann in einem einzigen Röhrchen durchgeführt werden. Wenn das Wasser entfernt wird, wird es durch einen Hilfsstoff wie Trehalose, Dextran oder Laktose ersetzt. Die Verwendung von Lyophilisierungsperlen trägt zur Standardisierung des Prozesses bei.

Die Optimierung eines PCR-Assays erfordert Elemente von Wissenschaft, Kunst, Versuch und Irrtum und Geduld. Zu wissen, was schief gehen könnte und was man in solchen Situationen tun kann, entscheidet oft über den Ausschlag vom Scheitern zum Erfolg.

Verweise

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