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Nov 28, 2023

Sammlung von Bioproben von den Eltern

BMC Nutrition Band 8, Artikelnummer: 141 (2022) Diesen Artikel zitieren 1397 Zugriff auf 3 altmetrische Metrikdetails Nicht-invasive menschliche Bioproben, einschließlich Stuhl, Urin und Haare, sind wichtig in

BMC Nutrition Band 8, Artikelnummer: 141 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Nicht-invasive menschliche Bioproben, einschließlich Stuhl, Urin und Haare, sind wichtig für das Verständnis des Zusammenhangs zwischen Ernährung und Veränderungen in physiologischen Prozessen des Menschen, die sich auf die Folgen chronischer Krankheiten auswirken. Allerdings kann die Sammlung von Bioproben schwierig sein, wenn Proben für Forschungsstudien gesammelt werden, die nicht an einem zentralen Ort stattfinden. Wir beschreiben das Protokoll und die Machbarkeit der Sammlung von Stuhl-, Urin- und Haarbioproben von Eltern und ihren Kindern an einem abgelegenen Ort als Teil einer sommerlichen Gemeinschaftsgartenintervention.

Stuhl, Urin und Haare wurden im Rahmen der Summer Harvest Adventure (SHA)-Studie gesammelt, einer randomisierten, kontrollierten Gemeinschaftsgarten-Intervention für Kinder (Alter 8–11 Jahre) und ihre Eltern aus ressourcenarmen Vierteln. Zu Studienbeginn und nach der Intervention wurden Bioproben von willigen Kindern und/oder ihren Eltern/Erwachsenenbetreuern gesammelt, um Mikrobiom-, Metabolomik- und Haaranalysen sowohl in der Interventions- als auch in der Kontrollgruppe an einem Ort zu evaluieren, der von den akademischen Labors, die die Analyse durchführen, entfernt ist. Das zur Zusammenstellung, Lieferung, Entnahme und Verarbeitung von Bioproben verwendete Protokoll wird zusammen mit der Häufigkeit, mit der Proben erfolgreich entnommen wurden, vorgestellt.

Einhundertsechsundvierzig Teilnehmer (73 Eltern-Kind-Dyaden) waren Teil der größeren SHA-Studie und daher berechtigt, eine Bioprobe bereitzustellen. Insgesamt stimmten 126 Teilnehmer, 115 Teilnehmer und 127 Teilnehmer der Abgabe ihrer Haar-, Stuhl- und Urinproben zu. Von den Teilnehmern, die der Abgabe einer Probe zustimmten, stellten 44 Kinder (69,8 %) und 38 Eltern (60,3 %) mindestens eine Haarprobe zur Verfügung, 27 Kinder (48,2 %) und 37 Eltern (62,7 %) stellten mindestens eine Stuhlprobe zur Verfügung. und 36 Kinder (57,1 %) und 42 Eltern (65,6 %) stellten mindestens eine Urinprobe zur Verfügung. Die Probenentnahme am externen Standort, der Transport und die Handhabung im akademischen Zentrum verliefen erfolgreich und alle Bioproben wurden für die Analyse als ausreichend erachtet. Die DNA- und Metabolomik-Ausbeute an einer Teilmenge der erhaltenen Stuhlproben lieferte erwartungsgemäß hervorragende Ergebnisse im Hinblick auf eine Fülle von Arten und Metaboliten. Urin- und Haaranalysen sind im Gange.

Unsere Arbeit ist eine der ersten, die die Machbarkeit der Sammlung menschlicher Bioproben, insbesondere Stuhl, Urin und Haare, von Eltern und ihren Kindern aus ressourcenarmen Gegenden in einer nicht-traditionellen Gartenforschungsumgebung beschreibt. Zukünftige Arbeiten werden über Erkenntnisse im Zusammenhang mit Mechanismen zwischen Ernährung, Mikrobiom, Metaboliten und klinischen Ergebnissen berichten.

Peer-Review-Berichte

Bioproben, die vom Menschen entnommenen biologischen Forschungsproben, spielen eine wichtige Rolle dabei, die mechanistischen Zusammenhänge zwischen Nahrungsaufnahme und physiologischen Veränderungen zu verstehen [1,2,3,4,5,6]. Nicht-invasive Bioproben, insbesondere Stuhl-, Urin- und Haar-Bioproben, sind ein wichtiger und wachsender Forschungsbereich und können Einblicke in interne biologische Prozesse liefern, ohne dass ein invasiver Eingriff erforderlich ist, was die Bereitschaft der Teilnehmer an Forschungsstudien erhöhen kann, diese bereitzustellen eine Probe. Beispielsweise können bei Erwachsenen die Aktivitäten des Darmmikrobioms den Zusammenhang zwischen Nahrungsaufnahme und Veränderungen des Blutdrucks durch Metaboliten wie kurzkettige Fettsäuren (SCFA) vermitteln, die im Stuhl gemessen werden können [7, 8]. Urin-Bioproben können durch die Messung von Trimethylamin-N-oxid im Urin Ernährungsmuster widerspiegeln, die das Risiko von Herz-Kreislauf-Erkrankungen erhöhen [9]. Haarbioproben wurden verwendet, um chronischen Stress durch Cortisol zu messen, und in jüngerer Zeit wurden sie verwendet, um die Aufnahme von zuckergesüßten Getränken durch Haarisotope abzuschätzen [10,11,12].

Die Zusammenhänge zwischen Nahrungsaufnahme, Darm- und Harnmikrobiota, Metaboliten und physiologischen Veränderungen sind wenig erforscht, insbesondere bei Kindern und Familien im weiteren Sinne [13,14,15]. Um die mechanistischen Zusammenhänge zwischen Nahrungsaufnahme und physiologischen Veränderungen vollständig zu verstehen, werden Bioproben von einer Vielzahl von Teilnehmern benötigt, darunter auch solche aus rassischen/ethnischen Minderheitengruppen und Familien aus armen Vierteln. Allerdings war die Sammlung von Bioproben aus diesen Gruppen aus verschiedenen Gründen sehr begrenzt [16, 17], darunter ein geringeres Verständnis über die Verwendung von Bioproben, die Notwendigkeit flexibler Sammelstrategien und eine mit der Teilnahme an Studien verbundene Belastung [18,19]. ,20]. Daher sind effiziente, praktikable und praktische Protokolle zum Sammeln von Bioproben in verschiedenen Umgebungen und Populationen erforderlich.

Während Sammlungsprotokolle für die Forschung in akademischen Zentren beschrieben wurden [21, 22], oft in einem Labor oder in klinischen Forschungsräumen, haben nur wenige Studien praktikable Sammlungsprotokolle für Studien beschrieben, die physisch außerhalb des akademischen Zentrums durchgeführt werden [22,23,24]. . Diese „externen“ Umgebungen sind von entscheidender Bedeutung, um eine breitere Bevölkerung zu erreichen und die Rekrutierung von Familien zu ermöglichen, die sonst möglicherweise nicht an der Forschung teilgenommen hätten, einschließlich aus ressourcenarmen Vierteln oder Minderheitenrassengruppen [17]. Protokolle in diesen externen Umgebungen erfordern erfolgreiche Rekrutierungsansätze, akzeptable Probenentnahmemethoden, die für Familien durchführbar sind, und einen angemessenen Transport und eine angemessene Verarbeitung der Proben, die die Integrität der Proben wahren. Studien, die darauf abzielen, nicht-invasive Bioproben zu untersuchen, müssen gültige, reproduzierbare und standardisierte Methoden verwenden, um die Datenvergleichbarkeit zwischen Studien zu verbessern, da Unterschiede in den Erhebungsmethoden zur Variabilität zwischen Studien beitragen können.

Unseres Wissens hat keine Studie die Machbarkeit der Sammlung nicht-invasiver menschlicher Bioproben, insbesondere Stuhl, Urin und Haare, von Eltern und ihren Kindern in einem nicht-traditionellen Forschungsumfeld, insbesondere an einem Gartenstandort, beschrieben. Daher beschreiben wir die Forschungsprotokolle zur Sammlung von Stuhl-, Urin- und Haarbioproben von Eltern-Kind-Dyaden, die an einer randomisierten kontrollierten Studie, Summer Harvest Adventure (SHA), teilgenommen haben, einer familienbasierten, mehrkomponentigen gemeinschaftlichen Gartenintervention.

Summer Harvest Adventure (SHA) ist eine 3-jährige, randomisierte, kontrollierte Studie, die sich an Kinder (im Alter von 8–11 Jahren) und ihre Eltern/erwachsenen Betreuer aus armen Vierteln richtet, die nach dem Zufallsprinzip einer gartenbasierten Interventionsgruppe oder einer erweiterten Kontrollgruppe zugeteilt werden. Die Intervention bestand aus wöchentlicher evidenzbasierter Gruppenschulung, der Ernte von Obst, Gemüse und Kräutern, Kochvorführungen, Ernährungsberatung aus der Ferne, die durch motivierende Interviews unterstützt wurde, und E-Technologien. Kontrollfamilien erhielten Standard-USDA-Schulungsmaterialien. Kurz gesagt umfassten die Einschlusskriterien Kinder (Alter 8–11 Jahre) und ihre Eltern/erwachsenen Betreuer (im Folgenden Eltern), englischsprachige Dyaden und Bewohner von Gemeinden, die für das Supplemental Nutrition Assistant Program (SNAP) in Frage kommen, in Franklin County, Ohio (wie von festgelegt). (Bundesfinanzierung der Nachbarschaftsschule) und die Möglichkeit, Obst und Gemüse zu konsumieren, ohne sich Gedanken über Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Nährstoffen machen zu müssen (z. B. Warfarin). Bei dieser verschachtelten Beobachtungsstudie erfolgte die nicht-invasive Sammlung von Bioproben im zweiten Jahr der SHA-Studie (2019) und war ein vom IRB genehmigter, optionaler Teil der Studie. Willige Teilnehmer unterzeichneten eine ergänzende Einwilligung/Zustimmung zur Bereitstellung von Stuhl-, Urin- und/oder Haarproben im Rahmen der Studie. Die Proben wurden etwa zum Zeitpunkt des Basisbesuchs (T-0) und der Besuche nach der Intervention (T + 12 Wochen) zusammen mit anderen objektiven und thematischen Studienmaßnahmen entnommen. Da es sich um eine übergreifende Zusammenarbeit zwischen zwei akademischen Zentren handelte, überprüften und genehmigten die Institutional Review Boards aller Standorte die Studie.

Stuhl- und Urinproben wurden von willigen Kindern und ihren Eltern zu Hause gesammelt. Haarproben wurden an einem externen Forschungsstandort am Tag der Erstbesuche und der Besuche nach der Intervention gesammelt, als andere körperliche Messungen und Untersuchungsmaßnahmen durchgeführt wurden. Vor der Bioprobenentnahme wurden Stuhl- und Urinsammelsets zusammengestellt. Bei der Zusammenstellung des Kits und der Verarbeitung der Proben wurde eine aseptische Technik eingesetzt, um vom Labor verursachte Kontaminationen zu minimieren, einschließlich der Verwendung von Handschuhen, Laborkitteln und der Desinfektion von Oberflächen mit 70 %iger Ethanollösung. Die für die Stuhl- und Urin-Kits verwendeten Materialien sowie die Materialien zur Sammlung von Haarproben sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Der Inhalt jedes Stuhl- und Urinsammelkits ist in Abb. 1 dargestellt. Da die Stuhl- und Urinproben für mehrere Zwecke verarbeitet werden sollten (z. B. Analyse der Mikrobiomzusammensetzung, Metabolitenanalyse), wurden die Proben in Behältern ohne Konservierungsstoffe (z. B , RNase später). Alle Entnahmematerialien und Behälter waren mit einer Studien-ID versehen, die auch darauf hinwies, ob es sich um eine Eltern- oder Kinderprobe handelte, sowie mit Leerzeilen, damit die Teilnehmer das Datum und die Uhrzeit der Probenentnahme eingeben konnten.

Stuhl- und Urinsammelsets

Vor der Verteilung von Stuhl- und Urinsammelsets und der Haarentnahme wurde jedem Einzelnen, der sich bereit erklärte, eine Probe abzugeben, ein Fragebogen zur Probenentnahme ausgehändigt (d. h. es wurde ein separater Fragebogen für den Elternteil und das Kind ausgehändigt, wenn beide der Abgabe einer Probe zustimmten). Probe). Die Eltern- und Kinderfragebögen umfassten Folgendes: Name, Dosis und Häufigkeit verschreibungspflichtiger Medikamente, Nahrungsergänzungsmittel, Kräuter oder Pflanzenstoffe; Selbstauskunft aller medizinischen Diagnosen; der Konsum und die Häufigkeit von Tabak- und Alkoholprodukten; Datum der letzten Menstruation (falls zutreffend); und das Vorhandensein oder Fehlen infektiöser Symptome. Aufgrund der möglichen Auswirkungen auf die Stuhlkonsistenz und -qualität erkundigte sich das Forschungsteam nach bestimmten rezeptfreien Medikamenten, darunter Pepto Bismol, Maalox, Mineralöl, Antazida und/oder Kaopectat. Kein Teilnehmer gab an, eines dieser Medikamente eingenommen zu haben. Den Teilnehmern wurde gesagt, sie sollten weiterhin alle chronischen Medikamente einnehmen, die sie zuvor eingenommen hatten (einschließlich Kräuter und Vitamine). Die Teilnehmer wurden auch auf mögliche Infektionssymptome untersucht, darunter neuer Durchfall oder weicher/ungeformter Stuhl, Dysurie, erhöhte Harnfrequenz und/oder die derzeitige Einnahme oraler/injizierter Antibiotika bei einer aktiven Infektion.

Haarproben wurden zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung und der Besuche nach der Intervention in einem privaten Bereich entnommen. Für die Stuhl- und Urinsammlung erhielt jeder Teilnehmer eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Probenentnahme zu Hause. Die Anweisungen wurden von einem ausgebildeten Forschungsassistenten überprüft und unbenutzte Materialien als visuelle Hilfsmittel verwendet. Darüber hinaus wurden die Anweisungen in einem einseitigen Handout detailliert beschrieben, das die Familien mit nach Hause nahmen (ergänzende Abbildungen 1 und 2). Die Teilnehmer wurden gebeten, innerhalb von drei Tagen eine Stuhlprobe und innerhalb von zwei Tagen nach der erwarteten Abgabe der Proben an einer vorher festgelegten Stelle an vorher festgelegten Tagen und Zeiten eine Urinprobe zu entnehmen.

Die Haare wurden nach zuvor festgelegten Protokollen gesammelt, die für diese Studie angepasst wurden [11, 25]. Kurz gesagt, es wurden Haare von Teilnehmern gesammelt, die eine Haarlänge von mindestens 1 cm hatten. Ungefähr 30 Haarsträhnen wurden auf dem hinteren Teil der Kopfhaut in Höhe der Ohren identifiziert. Die Haarscheren wurden vor jeder Entnahme mit einem Alkoholtupfer abgewischt und der Forschungsmitarbeiter, der die Proben entnahm, trug Handschuhe. Die Haarproben wurden mit einer stumpfen Haarschere entnommen, wobei die Proben so nah wie möglich an der Kopfhaut entnommen wurden, ohne dass die Person verletzt wurde. Die Haarprobe wurde dann mit Klebeband auf ein Blatt Papier geklebt, das mit der Studien-ID beschriftet war und mindestens 1 cm vom Ende der Kopfhaut entfernt angebracht wurde. Das Papier war beschriftet, um anzuzeigen, welches Ende von der Kopfhaut stammte. Anschließend wurde das Papier in einen mit der Studien-ID beschrifteten Umschlag gesteckt und verschlossen. Alle Umschläge wurden in einen größeren Manila-Ordner im Format 8 x 11 Zoll gelegt.

Die Teilnehmer wurden gebeten, nach Belieben eine Stuhlprobe ohne Urin oder andere Flüssigkeiten in den bereitgestellten Stuhlsammelbehälter zu entnehmen. Die Teilnehmer wurden gebeten, einen Teil ihres Stuhls von jedem Ende und der Mitte in den bereitgestellten Auffangbehälter zu schöpfen und den Deckel des Behälters unmittelbar nach dem Stuhlgang zu schließen. Nach angemessener Händehygiene wurden die Teilnehmer gebeten, das Datum und die Uhrzeit der Entnahme auf das Etikett außerhalb des Behälters zu schreiben, ihn in einen Biohazard-Beutel zu legen und die Probe sofort in ihrem heimischen Gefrierschrank einzufrieren.

Die Teilnehmer wurden gebeten, den ersten Leergutschein des Tages ein bis zwei Tage vor dem voraussichtlichen Abgabetag abzuholen. Die Teilnehmer wurden gebeten, vor der Entnahme nicht zu wischen und die Flüssigkeit in den bereitgestellten 90-ml-Plastikbecher zu entleeren und nach Beendigung den Deckel des Behälters zu schließen. Nach angemessener Händehygiene wurden die Teilnehmer gebeten, das Datum und die Uhrzeit der Entnahme auf das Etikett außerhalb des Behälters zu schreiben, ihn in einen Biohazard-Beutel zu legen und ihn sofort in den Kühlschrank zu Hause zu stellen.

Für die Abgabe eigener Stuhl- und/oder Urinproben und der ihres Kindes wurde ein vorab festgelegter Gemeinschaftsstandort mit vorgegebenen Tagen und Zeiten, einschließlich einer Mischung aus Tages- und Abendzeiten, bereitgestellt. Den Teilnehmern wurden eine Isoliertasche und mehrere Kühlakkus zur Verfügung gestellt, um die Proben von zu Hause zur Abgabestelle zu transportieren. Die Teilnehmer wurden angewiesen, die Probe(n) unmittelbar vor der geplanten Abgabe aus ihrem Kühl-/Gefrierschrank zu nehmen und den Zeitpunkt der Entnahme der Probe zu notieren. Die Eltern wurden bis zu dreimal (falls erforderlich) per E-Mail, Telefon oder SMS daran erinnert, Proben zurückzugeben.

Bei der Ankunft des Teilnehmers wurden die Proben von geschultem Forschungspersonal auf Folgendes überprüft: Die Proben wurden in der bereitgestellten Isoliertasche mit Eisbeutel geliefert, fühlten sich kalt an und waren entsprechend beschriftet. Ein kurzer Fragebogen wurde mündlich ausgehändigt, um sicherzustellen, dass es keine Änderungen an ihrem Medikamentenplan gab, keine neuen Infektionssymptome auftraten und die Teilnehmer sich an das Erhebungsprotokoll hielten. Das Datum und die Uhrzeit der Probenentnahme, -platzierung und -entnahme der Teilnehmer aus ihrem Kühl-/Gefrierschrank wurden ebenfalls dokumentiert. Nach Erhalt durch die Teilnehmer wurden die Proben auf Trockeneis gelegt oder sofort in einen 4 °C-Kühlschrank (Urin) bzw. -20 °C-Gefrierschrank (Stuhl) gestellt, bis sie zum Kooperationslabor im akademischen Zentrum transportiert wurden. Der Transport der Proben erfolgte mindestens einmal täglich und manchmal zweimal täglich, je nachdem, wann die Proben abgegeben wurden. Die Proben wurden auf Trockeneis in einem geschlossenen Styroporbehälter transportiert. Die Stuhlproben wurden sofort in den Gefrierschrank bei –80 °C gelegt, während die Urinproben vorübergehend für 12 Stunden in einen Kühlschrank bei 4 °C gestellt wurden, damit sie in konische 15-ml-Röhrchen aufgeteilt und anschließend in den Gefrierschrank bei –80 °C gestellt werden konnten.

Haarproben wurden in einem sicheren Lagerraum ohne Zugang zum Sonnenlicht aufbewahrt. Stuhl- und Urinproben wurden etwa 160 (Stuhl) und 180 (Urin) Tage nach der Entnahme verarbeitet, um die Koordinierung der Protokolle, Materialien und des Personals zu ermöglichen, die für die ordnungsgemäße Verarbeitung der Proben erforderlich sind. Die Probenverarbeitung wurde in Basisproben (V1) und Proben nach der Intervention (V2) sowie Eltern- und Kinderproben aufgeteilt, um Verwechslungen zu vermeiden. Die Proben wurden etwa 24 Stunden vor der Verarbeitung aus dem Gefrierschrank mit –80 °C entnommen und zum Auftauen in einen Kühlschrank mit 4 °C im Labor gestellt. Die bei der ersten Verarbeitung von Stuhl-, Urin- und Haarproben verwendeten Materialien sind in Tabelle 2 aufgeführt. Nachfolgend finden Sie spezifische Einzelheiten.

Der Probenbehälter, in dem die Teilnehmer Proben bereitstellten, wurde gewogen. Bevor der Stuhlbehälter in die Biosicherheitshaube gestellt wurde, wurden die Behälter mit 70 %igem Ethanol besprüht, um die Außenfläche zu sterilisieren. In der Biosicherheitshaube wurde der Stuhlbehälter geöffnet, die Stuhlkonsistenz anhand der Bristol-Stuhltabelle [26] beurteilt und der Stuhl mit einem sterilisierten Zungenspatel homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurden die Proben in 2-ml-Aliquots gegeben. Für jede geplante Analyse wurden drei Aliquots reserviert, also insgesamt 24 Aliquots pro Person. Zusätzliche Reagenzien wurden den erforderlichen Reagenzien hinzugefügt (z. B. wurde C13-Butyrat für die SCFA-Analyse hinzugefügt). Alle Proben wurden nach Fertigstellung der Aliquots gewogen und wieder in den Gefrierschrank bei –80 °C gestellt.

Die konischen 15-ml-Röhrchen wurden aus dem 4 °C-Kühlschrank genommen, gewogen und mit 70 %igem Ethanol besprüht, um die Außenfläche zu sterilisieren. Der Urin wurde vorsichtig homogenisiert und 1,5 ml Urin wurden in jedes 2-ml-Kryoröhrchen gegeben. Für jede geplante Analyse wurden drei Aliquots erstellt, also insgesamt 12 Kryoröhrchen pro Probe. Zusätzliche Reagenzien wurden zu denen hinzugefügt, die sie für zukünftige geplante Analysen benötigten. Die Kryoröhrchen wurden gewogen und zurück in den Gefrierschrank bei −80 °C gestellt.

Gefrorene Stuhlproben wurden aufgetaut und etwa 10 mg wurden für die DNA-Extraktion unter Verwendung eines QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen verwendet. Der Inhalt wurde 45 Minuten lang bei 37 °C in Lysozym-Mutanolysin-Puffer (22 mg/ml Lysozym, 0,1 U/ml Mutanolysin, 20 mM TrisHCl, 2 mM EDTA, 1,2 % Triton-x, pH 8,0) inkubiert, bevor er 150 Minuten lang homogenisiert wurde s mit 0,1 mm großen Zirkoniaperlen. Die Proben wurden dann 5 Minuten lang bei 95 °C mit InhibitEX-Puffer und 10 Minuten lang bei 70 °C mit Proteinase K und Puffer AL inkubiert. Im Anschluss an diesen Schritt wurde das Isolationsprotokoll des QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit befolgt, beginnend mit dem Ethanolschritt. Die DNA wurde mit dem Qubit 2.0 Fluorimeter (Life Technologies, Carlsbad, CA) unter Verwendung des dsDNA Broad Range Assay Kit quantifiziert.

Hier haben wir kurz die Validierungsanalyse zum Nachweis der Messung kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) im Stuhl beschrieben. Einzelheiten einschließlich der benötigten Chemikalien, der SCFA-Derivatisierung und Probenvorbereitung sowie der Validierungsanalyse sind im ergänzenden Anhang enthalten.

Aufgrund ihrer Flüchtigkeit sind die SCFAs im Allgemeinen nicht einfach mit dem Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-System (LC-MS) nachzuweisen. Daher ist eine chemische Derivatisierungsmethode erforderlich, um ihre Nachweisbarkeit zu erhöhen, wie bereits berichtet [27]. Der Kot wurde mit einem Propanol-Verhältnis von 2:1 (Gew./Gew.) hergestellt und diesen Proben wurde 13C4-Natriumbutyrat zugesetzt, das als interner Standard diente. Anschließend wurden die Proben bis zur Analyse bei -80 °C eingefroren. Vor der Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatographie – Analyse mit hochauflösendem Massenspektrometer (UPLC-HRMS) wurden 60 µL Stuhlprobenlösung und 200 µL 50 % Acetonitril zur SCFA-Extraktion hinzugefügt. Nach 2-minütigem Vortexen wurden die Proben 10 Minuten lang bei 23.748 × g zentrifugiert und 40 µl Überstand wurden zur Derivatisierung gemäß den im ergänzenden Anhang beschriebenen Verfahren verwendet. Zur Analyse derivatisierter SCFAs wurde ein Thermo Scientific Vanquish Flex UPLC-gekoppeltes Q Exactive (QE)-System verwendet. Gemäß der FDA-Richtlinie zur Validierung bioanalytischer Methoden [28] wurden die Kalibrierungskurve, Genauigkeit, Präzision, Wiederfindung und Stabilität der gezielten SCFAs wie in unserer früheren Studie beschrieben validiert [29].

Jeder Teilnehmer erhielt für die von ihm bereitgestellten Proben eine Vergütung: Geschenkgutscheine im Wert von 10 $ pro Haar- und Stuhlprobe und Geschenkgutscheine im Wert von 5 $ pro Urinprobe. Somit könnten die Teilnehmer bis zu 50 US-Dollar (bis zu 100 US-Dollar pro Dyade) erhalten, wenn sie alle Proben bei den Erstuntersuchungen und bei den Besuchen nach der Intervention zur Verfügung stellten. Außerdem wurde eine zusätzliche Geschenkkarte im Wert von 5 US-Dollar zur Verfügung gestellt, um diejenigen zu entschädigen, die eine zusätzliche Anfahrt (außerhalb der im Voraus geplanten Zeiten) auf sich nahmen, um die Exemplare zu liefern. Die Entschädigung wurde zum Zeitpunkt der Probenabgabe gewährt.

Zur Beschreibung demografischer Merkmale wurden Mittelwerte und Standardabweichungen bzw. Häufigkeiten und Prozentwerte verwendet. Die Varianzanalyse (ANOVA) für kontinuierliche Variablen und Chi-Quadrat-Tests für kategoriale Variablen wurden verwendet, um Unterschiede in den demografischen Merkmalen zu testen, je nachdem, ob die Teilnehmer zustimmten, eine Basisstichprobe bereitstellten oder sowohl eine Basisstichprobe als auch eine Stichprobe nach der Intervention bereitstellten. Alle Analysen wurden mit SPSS (v28; IBM) durchgeführt.

Insgesamt 73 Eltern-Kind-Dyaden (146 Teilnehmer) stimmten der Teilnahme an der SHA-Studie im Jahr 2019 zu, von denen 36 Dyaden (72 Teilnehmer) in den erweiterten Kontrollarm und 37 Dyaden (74 Teilnehmer) in den Interventionsarm randomisiert wurden. Das Durchschnittsalter der teilnehmenden Kinder betrug 8,8 Jahre, 60,3 % waren weiblich und 54 % identifizierten sich als Afroamerikaner oder Mischling (Tabelle 3). Eltern und Kinder jeder Dyade hatten die Möglichkeit, unabhängig von ihrem Interventionsarm Haar-, Stuhl- und Urinproben abzugeben (Abb. 2). Insgesamt erklärten sich 126 Teilnehmer (64 Kinder, 62 Eltern), 115 Teilnehmer (56 Kinder, 59 Eltern) und 127 Teilnehmer (63 Kinder, 64 Eltern) bereit, ihre Haar-, Stuhl- und Urinproben abzugeben (Abb. 2). Von den Teilnehmern, die der Abgabe einer Haarprobe zugestimmt hatten, stellten 56 Kinder (87,5 %) und 53 Eltern (85,5 %) zu Studienbeginn eine Probe zur Verfügung und 44 Kinder (68,8 %) und 38 Eltern (61,3 %) stellten zu Beginn eine Probe zur Verfügung. Interventionsbesuch; 30 Eltern-Kind-Dyaden stellten sowohl bei Erstbesuchen als auch bei Besuchen nach der Intervention eine Probe zur Verfügung. Von den Teilnehmern, die der Abgabe einer Stuhlprobe zustimmten, stellten 29 Kinder (51,8 %) und 38 Eltern (64,4 %) zu Studienbeginn eine Probe zur Verfügung und 27 Kinder (48,2 %) und 37 Eltern (62,7 %) stellten zu Beginn eine Probe zur Verfügung. Interventionsbesuch; 23 Eltern-Kind-Dyaden stellten sowohl bei Erstbesuchen als auch bei Besuchen nach der Intervention eine Probe zur Verfügung. Von den Teilnehmern, die der Abgabe einer Urinprobe zugestimmt hatten, stellten 45 Kinder (71,4 %) und 49 Eltern (76,6 %) zu Studienbeginn eine Probe zur Verfügung und 36 Kinder (57,1 %) und 42 Eltern (65,6 %) stellten zu Beginn eine Probe zur Verfügung. Interventionsbesuch; 36 Eltern-Kind-Dyaden stellten sowohl bei Erstbesuchen als auch bei Besuchen nach der Intervention eine Probe zur Verfügung. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Studienarmen in Bezug auf Kinder und Eltern, die zustimmten, eine Basisprobe zur Verfügung stellten oder sowohl eine Basisprobe als auch eine Nachinterventionsprobe zur Verfügung stellten (Tabelle 3). Die demografischen Profile waren bei den Teilnehmern, die eine Bioprobenprobe zur Verfügung stellten, ähnlich wie bei den Teilnehmern, die keine Probe zur Verfügung stellten (Tabelle 3).

Teilnehmer-Flussdiagramm

Teilnehmer, die der Bereitstellung einer Bioprobenprobe zustimmten, aber keine Probe zurücksendeten, wurden kontaktiert. Von den 15 Familien, die kontaktiert wurden, weil sie keine Urinprobe zur Verfügung gestellt hatten, und von 22 Teilnehmern, die kontaktiert wurden, weil sie keine Stuhlprobe zur Verfügung gestellt hatten, gaben 11 an, dass sie zeitliche Engpässe hatten, neun brachen diesen Teil der Studie ab, zwei gaben an, dass sie es vergessen hatten, und drei zitierte neue Magen-Darm-Störungen.

Bei den Teilnehmern, die eine Probe zur Verfügung stellten, betrug die mittlere Zeit von der Probenentnahme bis zur Abgabe am externen Standort 10,1 (IQR: 4,8–25,4) Stunden für Stuhl und 10,4 (IQR: 8,9–78,5) Stunden für Urin Ausgangsproben und 11,2 (IQR: 6,8–29,5) Stunden für Stuhl und 10,0 (IQR: 7,9–13,1) Stunden für Urin für Post-Interventionsproben. Alle Teilnehmer lagerten die Proben wie angewiesen zu Hause und entnahmen die Proben innerhalb einer Stunde nach der Abgabe ihrer Probe. Die mittlere Zeit zwischen der Herstellung der Bioprobe und dem Einfrieren der Proben in einem Gefrierschrank bei -80 °C betrug 13,2 (IQR: 7,4–27,9) Stunden für Stuhl und 26,7 (IQR: 24,2–28,0) Stunden für Urin für Basislinienproben und 14,6 (IQR). : 10,6–32,1) Stunden und 33,7 (IQR: 31,3–37,8) Stunden für Stuhl- und Urinproben nach der Intervention.

Es wurde festgestellt, dass alle bereitgestellten Stuhl- und Urinproben von ausreichender Qualität und Quantität waren, um zusätzliche Analysen zu unterstützen. An 91 Proben wurde eine DNA-Extraktion durchgeführt, die eine durchschnittliche Ausbeute von 24,60 +/- 3,47 µg/ml DNA ergab. Diese DNA wurde zur 16 S-rRNA-Gensequenzierung eingereicht, über die in zukünftigen Studien berichtet wird. Darüber hinaus wurden SCFA-Analysen an 40 Proben durchgeführt, über deren Ergebnisse bereits berichtet wurde [30].

Unsere gemeinsame Forschungsgruppe konnte zeigen, dass wir erfolgreich nicht-invasive Bioproben, insbesondere Stuhl-, Urin- und Haarproben, von Eltern- und Kinderteilnehmern aus ressourcenarmen Vierteln außerhalb des traditionellen akademischen Umfelds, insbesondere einem Gemeinschaftsgartenstandort, sammeln können. Wir haben ein erfolgreiches Protokoll zur Sammlung nicht-invasiver Bioprobenproben mithilfe etablierter Sammelmethoden entwickelt [22,23,24] und es im Hinblick auf die Beteiligung der Teilnehmer und die Durchführbarkeit modifiziert, ohne die Probenintegrität zu beeinträchtigen. Wir glauben, dass dieses Protokoll auf andere Studien in ähnlichen Umgebungen außerhalb des traditionellen akademischen Forschungsumfelds angewendet werden kann. Während die Selbstsammlung von Stuhl aufgrund der Möglichkeit wiederholter Einfrier-/Auftauzyklen weniger optimal ist, konnten wir zeigen, dass unser Protokoll für Familien praktisch ist und dennoch gültige und zuverlässige Daten liefert.

Von den 146 teilnahmeberechtigten Teilnehmern stellten mehr als die Hälfte der Eltern und ihrer Kinder eine Bioprobenprobe zur Verfügung. Unsere Erfahrung lässt darauf schließen, dass es zu einer verstärkten Rekrutierung kommen kann, wenn Vorführungen zum Probenentnahmeprozess in Verbindung mit klaren Anweisungen im persönlichen Gespräch erfolgen. Dies steht im Einklang mit früheren Studien zur Sammlung von Bioproben, die ebenfalls eine erhöhte Beteiligung bei persönlicher Rekrutierung gezeigt haben [31]. Während der Prozentsatz derer, die zustimmten und eine Probe zurücksendeten, suboptimal war, gaben von den Kindern und Eltern, die eine Basisprobe zurücksendeten, mehr als 70 % eine Probe nach der Intervention ab, wobei der Prozentsatz der Teilnehmer, der eine zweite Stuhlprobe abgab, höher war als die der Haarprobe oder Urinprobe. Meistens waren diejenigen, die keine Probe nach der Intervention zurückbrachten, auch selten bei den Gartenarbeitssitzungen anwesend (wenn sie zur Interventionsgruppe gehörten) oder kamen nicht zu einem Besuch nach der Intervention zurück (sowohl bei der Interventions- als auch bei der Kontrollgruppe). Es ist nicht klar, warum es eine höhere Rückgabequote für Stuhlproben gab, obwohl es plausibel ist, dass Eltern und Kinder, die sich für die Abgabe einer Stuhlprobe entschieden hatten, stärker an der Studie beteiligt waren und daher eher bereit waren, eine zweite Probe abzugeben. Es ist auch plausibel, dass diese Familien am meisten von der finanziellen Entschädigung profitierten, da der finanzielle Anreiz für die Rückgabe einer Stuhlprobe höher war.

Frühere Studien haben auch gezeigt, dass alternative Protokolle zum Sammeln von Bioproben außerhalb einer zentralen Sammelstelle in einem akademischen Zentrum möglich und machbar sind [22,23,24, 32, 33]. Unsere Studie ist jedoch die erste, die ein Protokoll zur Sammlung mehrerer nicht-invasiver Bioproben sowohl bei Eltern als auch bei Kindern aus ressourcenarmen Gegenden beschreibt. Darüber hinaus konnten wir eine angemessene Beteiligung an der Sammlung mehrerer Bioprobenproben in einer Population nachweisen, die traditionell schwer zu rekrutieren war [16]. Während ein großer Nachteil, wenn keine Bioproben in einem akademischen Zentrum gesammelt werden, der Verzicht auf die Möglichkeit zur sofortigen Lagerung und Verarbeitung von Proben ist, ist eine Reise zu akademischen Zentren für die Teilnehmer oft nicht möglich [19, 20]. Wir glauben, dass das von uns skizzierte Protokoll ein besseres „Gleichgewicht“ zwischen herkömmlichen Erhebungsmethoden und Tests per Post zu Hause (die den einzelnen Teilnehmer oder die Familie belasten) darstellt. Wir haben gezeigt, dass unser Protokoll für Familien praktisch ist, um Proben bequem von zu Hause aus zu sammeln, und zwar innerhalb eines Rahmens, der sicherstellt, dass die Probenintegrität nicht verloren geht. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass wir sowohl kindliche Teilnehmer als auch deren Eltern angemessen rekrutieren können. Methoden zur Sammlung von Stuhl und Urin bei Kindern zu Hause werden in der Literatur nur unzureichend beschrieben [33]. Wenn wir jedoch sowohl Kinder- als auch Elternproben haben, können wir in Zukunft einzigartige Hypothesen testen, einschließlich der Übereinstimmung von Mikrobiota und Metaboliten sowie Unterschieden bei physiologischen Veränderungen, die aufgrund des Eingriffs auftreten können. Das Verständnis dieser Zusammenhänge hilft uns, die Mechanismen rund um die generationsübergreifenden Risiken chronischer Krankheiten besser zu verstehen, was ein wachsendes und wichtiges Forschungsgebiet darstellt.

Unsere DNA-Isolierungsmethode, die der von anderen verwendeten ähnelt, führte zu einer hohen Ausbeute an DNA, die für die 16 S-rRNA-Gensequenzierung eingereicht wurde. Aus jeder Probe wurden erfolgreich Amplicon-Bibliotheken erstellt und führten zur Generierung hochwertiger Mikrobiomdaten, über die in zukünftigen Manuskripten berichtet wird. Unser Ansatz war in der Lage, die Probenintegrität bei anderen nachzuahmen, die den Mail-In-Ansatz verwendet haben, allerdings ohne den Einsatz von DNA-Stabilisatoren [22,23,24, 32].

Unser Protokoll unterliegt Einschränkungen. Zunächst wurde die Sammlung von Bioproben in eine größere randomisierte kontrollierte Studie eingebettet. Obwohl die Sammlung der Bioproben erfolgreich war, war sie angesichts der geringeren Rücklaufquoten für die Probe nach dem Eingriff immer noch suboptimal. Eine weitere Einschränkung ist die lange Verzögerung bei der anfänglichen Verarbeitung von Stuhl- und Urinproben, die die Zugabe von Reagenzien zur Messung des Metabolitenzerfalls (z. B. 13 C-Butyrat) beinhaltete. Während die Proben von den Teilnehmern sofort in heimische Gefrierschränke und innerhalb weniger Tage nach der Produktion in Gefrierschränke mit -80 °C gelegt wurden, kann dies die Stabilität der Metaboliten beeinträchtigen. Zukünftige Iterationen werden sich darauf konzentrieren, diese Verarbeitungszeit zu verkürzen. Schließlich ist unser Protokoll, obwohl es in dieser Kohorte erfolgreich war, möglicherweise nicht auf andere Bevölkerungsgruppen übertragbar, da es Teil einer größeren Intervention war und sich nur auf 8–11-jährige Kinder und ihre Eltern konzentrierte. Möglicherweise müssen die Protokolle für andere Altersgruppen und Bevölkerungsgruppen angepasst werden.

Zusammenfassend beschreiben wir ein Protokoll für die erfolgreiche Sammlung nicht-invasiver Bioproben für eine breite Palette zukünftiger Analysen bei Eltern und ihren Kindern aus ressourcenarmen Vierteln im Rahmen einer randomisierten, kontrollierten Gemeinschaftsgartenintervention. Das Sammelprotokoll war machbar und lieferte Proben, die für die Analyse geeignet waren. Dieser Ansatz kann für ähnliche randomisierte kontrollierte Studien oder Beobachtungsstudien wiederholt werden.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir sind den Familien dankbar, die am Summer Harvest Adventure teilgenommen haben. Wir danken auch allen Forschungsassistenten und Labormitgliedern und danken Pedro Marte-Ortiz, Ashlea Braun, Emily Hill, Jade Smith, Sarah Imwalle und Ashley Kennedy für ihren unermüdlichen Beitrag in verschiedenen Aspekten dieses Projekts.

Summer Harvest Adventure wurde durch ein USDA-Stipendium (USDA 2017-68001-26353) finanziert, das Colleen Spees gewährt wurde. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des US-Landwirtschaftsministeriums wieder.

Pädiatrie in der Grundversorgung, Nationwide Children's Hospital, 700 Children's Dr, Columbus, OH, 43205, USA

Amrik Singh Khalsa

Center for Child Health Equity and Outcomes Research, Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children's Hospital, 700 Children's Dr, Columbus, OH, 43205, Vereinigte Staaten

Amrik Singh Khalsa und Kelly J. Kelleher

Abteilung für Pädiatrie, College of Medicine, Ohio State University, Columbus, OH, 43210, USA

Amrik Singh Khalsa, Michael T. Bailey, Kelly J. Kelleher und Ross M. Maltz

Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University, Dublin, OH, 43016, USA

Jonathan Burton

Zentrum für mikrobielle Pathogenese, Nationwide Children's Hospital, Columbus, OH, 43205, USA

Michael T. Bailey und Ross M. Maltz

Forschungsaffinitätsgruppe für orale und gastrointestinale Mikrobiologie, Abigail Wexner Research Institute am Nationwide Children's Hospital, Columbus, OH, 43205, USA

Michael T. Bailey und Ross M. Maltz

College of Education and Human Ecology, Department of Human Sciences, The Ohio State University, Columbus, OH, 43210, USA

Jiangjiang Zhu

James Comprehensive Cancer Center, Ohio State University, Columbus, OH, 43210, USA

Jiangjiang Zhu

Abteilung für pädiatrische Gastroenterologie, Hepatologie und Ernährung, Nationwide Children's Hospital, Columbus, OH, 43205, USA

Ross M. Maltz

Abteilung für Tierwissenschaften, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, USA

Brett R. Loman

Abteilung für Ernährungswissenschaften, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, USA

Brett R. Loman

Abteilung für medizinische Diätetik, College of Medicine, The Ohio State University, Columbus, OH, 43210, USA

Colleen K. Spees

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ASK entwarf die Studie, verfasste das erste Manuskript und prüfte und überarbeitete das Manuskript kritisch. JB führte Teile der Studie durch, verfasste das ursprüngliche Manuskript und überarbeitete das Manuskript kritisch. MTB konzipierte das Design der Studie, führte Teile der Analysen durch und überprüfte und überarbeitete das Manuskript. JZ konzipierte das Design der Studie, führte Teile der Analysen durch und überprüfte und überarbeitete das Manuskript. KJK konzipierte das Design der Studie und überprüfte und überarbeitete das Manuskript. RMM trug zum Design der Studie bei und überprüfte und überarbeitete das Manuskript. BRL konzipierte das Design der Studie, führte Teile der Analysen durch und überprüfte und überarbeitete das Manuskript. CS entwarf und konzipierte die Studie, koordinierte und überwachte die Datenerfassung und überprüfte und überarbeitete das Manuskript kritisch. Die Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Keiner.

Korrespondenz mit Amrik Singh Khalsa.

Alle Teilnehmer gaben eine unterzeichnete Einverständniserklärung (Elternteil) und Zustimmung (Kind) zur Teilnahme an der Elternstudie Summer Harvest Adventure ab. Um in dieses Teilprojekt einbezogen zu werden, mussten die Eltern darüber hinaus eine schriftliche Einverständniserklärung für sich selbst und/oder ihr Kind zur Bereitstellung einer Bioprobenprobe abgeben, und die teilnehmenden Kinder gaben ihr Einverständnis zur Bereitstellung von Bioprobenproben. Alle Probenentnahmemethoden wurden in Übereinstimmung mit dem Code 45 CFR 46 – Protection of Human Subjects des US-Gesundheitsministeriums, der Revised Common Rule und allen institutionellen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Diese Studie wurde vom Institutional Review Board der Ohio State University genehmigt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Ergänzender Anhang. Ergänzende Abbildung 1. Anweisungen zur Probenahme von Home Stool. Ergänzende Abbildung 2. Anweisungen zur Urinsammlung zu Hause.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Khalsa, AS, Burton, J., Bailey, MT et al. Sammlung von Bioproben von Eltern-Kind-Dyaden im Rahmen einer Ernährungsintervention im Gemeinschaftsgarten: Protokoll und Durchführbarkeit. BMC Nutr 8, 141 (2022). https://doi.org/10.1186/s40795-022-00640-6

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Eingegangen: 11. Mai 2022

Angenommen: 18. November 2022

Veröffentlicht: 05. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s40795-022-00640-6

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