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Aug 31, 2023

Eine Störung des Zytoskeletts erhöht die arrhythmogene Anfälligkeit während der sympathischen Stimulation in einem Modell der hypertrophen Kardiomyopathie

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11296 (2023) Diesen Artikel zitieren 338 Zugriffe auf 5 Altmetric Metrics-Details Patienten mit familiärer hypertropher Kardiomyopathie (FHC) wird empfohlen, anstrengende Aktivitäten zu vermeiden

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Patienten mit familiärer hypertropher Kardiomyopathie (FHC) wird aufgrund des erhöhten Risikos für Herzrhythmusstörungen empfohlen, anstrengende Übungen zu vermeiden. Mäuse, die die menschliche FHC-verursachende Mutation R403Q im Myosin-Schwerketten-Gen (MYH6) exprimieren, rekapitulieren den menschlichen Phänotyp, einschließlich Zytoskelett-Unordnung und erhöhter Anfälligkeit für Arrhythmien. Nach der In-vivo-Verabreichung von Isoproterenol zeigten mutierte Mäuse Tachyarrhythmien, schlechte Erholung und Müdigkeit. Arrhythmien wurden mit dem β-Blocker Atenolol und dem Proteinkinase-A-Inhibitor PKI abgeschwächt. Mutierte Herzmuskelzellen hatten deutlich verlängerte Aktionspotentiale und lösten aufgrund der verringerten Repolarisationsreserve und der Connexin-43-Expression Automatismus aus. Isoproterenol verkürzte die Zykluslänge und verstärkte die elektrische Instabilität. Überraschenderweise erhöhte Isoproterenol den CaV1.2-Strom nicht. Wir fanden Veränderungen in der Kolokalisierung des adrenergen Rezeptors CaV1.2-β1, die mittels hochauflösender Nanoskopie beurteilt wurden, und eine erhöhte CaV1.2-Phosphorylierung in mutierten Herzen. Unsere Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass eine veränderte Ionenkanalexpression, Co-Lokalisierung und β-adrenerge Rezeptor-Signalübertragung, die mit einer Myozyten-Unordnung verbunden sind, zur elektrischen Instabilität im R403Q-mutierten Herzen beitragen.

Arrhythmien und ein vorzeitiger plötzlicher Tod sind tragische Folgeerscheinungen bei Patienten mit angeborenen Herzerkrankungen, die bei erhöhter sympathischer Aktivität auftreten können1,2,3. Die familiäre hypertrophe Kardiomyopathie (FHC) ist eine primäre Erkrankung des Myokards, die durch Herzhypertrophie ohne andere Belastungsbedingungen gekennzeichnet ist. Es handelt sich um eine autosomal-dominant vererbte Erkrankung, die durch Defekte in vielen Genen, die für Sarkomerproteine ​​kodieren, verursacht wird. Die meisten krankheitsverursachenden Varianten befinden sich in der schweren Beta-Myosin-Kette (MYH7) und im Myosin-bindenden Protein C (MYBPC3)4. Es ist allgemein bekannt, dass das Fortschreiten von FHC einen veränderten Energiestoffwechsel, eine Umgestaltung der Myozyten, eine Desorganisation von Zytoskelettproteinen und Fibrose mit sich bringt und zu schwerwiegenden unerwünschten kardialen Ereignissen wie Herzinsuffizienz und plötzlichem Herztod führt5,6,7. Es wird angenommen, dass intensives Training ventrikuläre Tachyarrhythmien begünstigt. Daher wird FHC-Patienten empfohlen, intensive körperliche Aktivität und Leistungssport zu vermeiden8. Obwohl Fibrose und Hypertrophie anerkannte Substrate für Arrhythmien sind, können Veränderungen der elektrischen Eigenschaften des Herzmuskels und seiner Reaktion auf adrenerge Stimulation auch zur Entstehung ventrikulärer Arrhythmien und des plötzlichen Herztodes beitragen1,9.

Beim Menschen verursacht die R403Q-Variante in MYH7 eine schwere Form von FHC, die durch eine früh einsetzende und fortschreitende Myokardfunktionsstörung mit einer hohen Inzidenz von plötzlichem Herztod gekennzeichnet ist10. Mäuse, die die R403Q-Mutation in MYH6 exprimieren, kodieren die vorherrschende Myosin-Isoform im Herzen erwachsener Mäuse, die in ihrer Sequenz hochgradig homolog zu MYH7 ist, und entwickeln ab einem Alter von 30 Wochen charakteristische Merkmale einer hypertrophen Kardiomyopathie5. Homozygote Mäuse sind bei der Geburt lebensfähig und sehen anatomisch normal aus, sterben jedoch am siebten Tag an schwerer dilatativer Kardiomyopathie. Mäuse, die heterozygot für die R403Q-MYH6-Mutation (αMHC403/+) sind, haben eine normale Lebensdauer und eine erhaltene Herzfunktion. Junge heterozygote Mäuse zeigen eine Myofibrillen-Desorientierung, eine Myozyten-Unordnung5, Veränderungen in der Kinetik des L-Typ-Kalziumkanals und eine veränderte mitochondriale Stoffwechselaktivität7, die der Entwicklung von Myozytenhypertrophie, Myozytenschädigung und Fibrose vorausgehen. Unabhängig vom Vorliegen einer Hypertrophie weisen die Herzen eine beeinträchtigte diastolische Funktion, eine Störung des Myozyten-Zytoskeletts und eine veränderte Energie auf11.

Ähnlich wie bei FHC-Patienten können bei αMHC403/+-hypertrophen Mäusen bei intensiver körperlicher Betätigung schwere Arrhythmien auftreten5,12. Die Pathophysiologie, die zur Entstehung von Arrhythmien beiträgt, ist unklar. Eine Studie mit hochauflösender optischer Kartierung von αMHC403/+ hypertrophen Herzen während der ventrikulären Stimulation ergab keinen direkten Zusammenhang zwischen der Menge oder dem Muster der Fibrose und der Induzierbarkeit von Arrhythmien13. Die Bildung von Arrhythmien auf zellulärer Ebene basiert auf zwei Schlüsselkonzepten: einer veränderten Kalziumhomöostase und einer verringerten Repolarisationsreserve14,15. Zusätzlich zu einer Erhöhung der Kalziumempfindlichkeit des Myofilaments16 zeigen αMHC403/+-Mäuse eine signifikante Verringerung des Kalziumgehalts des sarkoplasmatischen Retikulums7 aufgrund einer verringerten Expression von Calsequestrin, Triadin, Junctin und Ryanodinrezeptor 2 (RyR2), den Proteinen, die die kardiale Kalziumfreisetzungseinheit bilden11. Obwohl in Herzmuskelzellen, die aus präkardiomyopathischen αMHC403/+-Mäusen isoliert wurden, keine Unterschiede in der diastolischen oder systolischen Kalziumkonzentration gemessen wurden, verhinderten interessanterweise Kalziumkanalblocker wie Diltiazem die Entwicklung der Hypertrophie11,17. Darüber hinaus wurde über eine frühe Umgestaltung der repolarisierenden K+-Ströme vor der Entwicklung einer Hypertrophie bei der αMHC403/+-Maus berichtet, die zu Veränderungen der Repolarisation beiträgt18. Allerdings ist die Wirkung der Stimulation des sympathischen Nervensystems auf die Entstehung von Arrhythmien unklar.

Ziel dieser Studie war es, die Mechanismen zur Induktion von Arrhythmien im αMHC403/+-Mausmodell von FHC mit entwickelter Hypertrophie in Abwesenheit und Anwesenheit einer Stimulation des β-adrenergen Rezeptors zu untersuchen. Wir führten eine Reihe von In-vivo- und In-vitro-Studien durch und stellten fest, dass im Gegensatz zu den bei Wildkörperherzen beobachteten Effekten die Aktionspotentiale in αMHC403/+-Myozyten verlängert wurden und die Stimulation des β-adrenergen Rezeptors das Aktionspotential verkürzte, während gleichzeitig die Häufigkeit verzögerter Nachdepolarisationen und ventrikulärer Ereignisse zunahm Tachyarrhythmien. Dies wurde bei αMHC403/+-Mäusen nach einer In-vivo-Exposition mit Isoproterenol wiederholt. In Übereinstimmung mit der Zytoskelettstörung wurde die Kolokalisierung des CaV1.2-β1-adrenergen Rezeptors verändert, was durch hochauflösende Nanoskopie beurteilt wurde. CaV1.2 reagierte aufgrund der erhöhten Phosphorylierung in mutierten Herzen nicht auf Isoproterenol und die Connexin-43-Expression war signifikant verringert. Wir kommen zu dem Schluss, dass eine veränderte Expression, Position und Funktion von Ionenkanälen zu einer veränderten Signalübertragung des β-adrenergen Rezeptors und einer erhöhten Automatik beitragen. Unsere Daten belegen zum ersten Mal einen Zusammenhang zwischen Zytoskelett-Unordnung und Arrhythmiebildung im mutierten Herzen von R403Q.

Zunächst untersuchten wir die Wirkung des β-adrenergen Rezeptoragonisten Isoproterenol (ISO) auf die Induzierbarkeit von Arrhythmien in vivo. EKGs wurden bei 35–45 Wochen alten αMHC403/+- und Wildtiermäusen vor und nach intraperitonealer Injektion von 20 mg/kg ISO aufgezeichnet. Isoproterenol hat eine Halbwertszeit von 2,5 bis 5 Minuten19. Um die Arrhythmie-Induzierbarkeit über einen längeren Zeitraum zu überwachen, wurde 10 Minuten nach der ersten Injektion eine zweite Dosis von 20 mg/kg ISO verabreicht (Abb. 1A–D). Die Dosis wird gut vertragen und verursacht keine Myokardschädigung20. EKGs der Ableitung II wurden mit subdermalen Nadelelektroden ohne programmierte elektrische Stimulation aufgezeichnet. Vor der Verabreichung von ISO zeigten αMHC403/+-Mäuse im Vergleich zu Wildtiermäusen signifikant längere QT-, QTc-Intervalle und Tpeak Tend-Dauer (Tabelle 1). In Abwesenheit von ISO wurden bei αMHC403/+-Mäusen gelegentlich einzelne vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen (PVC) aufgezeichnet. Keine der Mäuse zeigte zu Studienbeginn oder nach der Verabreichung von Isoproterenol Vorhofarrhythmien.

Repräsentative Elektrokardiogramme (EKG) vor (A–B), während (C–D) und 2 Stunden nach (E–F) ip-Injektion von 2 × 20 mg/kg ISO in einem WT (A, C, E) und einem αMHC403/ + Maus (B, D, F). Signalgemittelte Komplexe zeigen deutliche Auswirkungen von ISO auf wt (G) und αMHC403/+-Maus (H). Repräsentative EKG-Aufzeichnungen einer αMHC403/+-Maus vor (I) und nach 1 mg/kg Atenolol (J) und nach ISO-Behandlung (K). (L) Wiederherstellung der αMHC403/+-Maus 2 Stunden nach ISO. (M–O) R–R-Intervalle aufgetragen gegen die Zeit für ISO-behandelte wt (M), αMHC403/+-Mäuse (N) und αMHC403/+-Mäuse, die 10 Minuten vor ISO wie angegeben mit Atenolol (Ate) behandelt wurden (O). Die unregelmäßigen RR-Intervalle, die Arrhythmien darstellen, können als Punkte nach ISO gesehen werden.

Nach der ISO-Behandlung zeigten sowohl wt-Mäuse als auch αMHC403/+-Mäuse eine deutlich höhere Herzfrequenz, die sich als Anstieg der Schläge pro Minute zeigte (Tabelle 1). Obwohl die QT- und QTc-Intervalle sowie die Tpeak Tend-Dauer bei αMHC403/+-Mäusen nach ISO leicht verkürzt waren, blieben sie im Vergleich zu Wildtiermäusen alle signifikant länger, während die R- und T-Amplituden signifikant reduziert wurden (Tabelle 1, Abb. 1G, H). Arrhythmische Ereignisse wurden als Anzahl unregelmäßiger Schläge pro Sekunde der Aufzeichnung berechnet und umfassten einzelne PVCs und ventrikuläre Tachykardien (Abb. 1D). Eine der acht αMHC403/+-Mäuse erlitt kurz nach der ISO-Injektion einen Herzstillstand und bei sechs der sieben überlebenden αMHC403/+-Mäuse wurden erhebliche Arrhythmien registriert (Tabelle 1). Eine der αMHC403/+-Mäuse zeigte keine spontanen oder induzierbaren ventrikulären Arrhythmien. Unsere Daten stimmen mit Berichten über Arrhythmien und plötzlichen Tod bei αMHC403/+-Mäusen nach kräftigem Schwimmen überein5.

Ein letztes EKG wurde zwei Stunden nach der Verabreichung von ISO erstellt. Das relative Auftreten arrhythmischer Ereignisse bei αMHC403/+-Mäusen war 2 Stunden nach ISO zehnmal höher als bei Wildtiermäusen, die ISO mit einer höheren Herzfrequenz ausgesetzt waren (Abb. 1E, F, N vs. M und Tabelle 1). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die 6 αMHC403/+-Mäuse, die über längere Zeit verschlimmerte arrhythmische Ereignisse aufwiesen, eine schlechte Erholung und Lethargie 2 Stunden nach der ISO-Injektion zeigten, was sich als Schwierigkeiten bei der Mobilisierung und verminderte Aktivität beim Bewegen im Käfig zeigte, was mithilfe der BAR-Tierüberwachung (hell, wachsam, reaktionsfähig) beurteilt wurde Kriterien und Bewertung (siehe Original-Überwachungsblätter in der Zusatzinformationsdatei). Dies stand im Gegensatz zu Wildwest-Mäusen, die nach der ISO-Injektion aktiv blieben und spontan gepflegt und gefüttert wurden.

Im Einklang mit der Entwicklung eines hypertrophen Phänotyps zeigten αMHC403/+-Mäuse im Vergleich zu Wildtiermäusen einen signifikanten Anstieg der Dicke der linksventrikulären Hinterwand und eine signifikante Abnahme des linksventrikulären Innendurchmessers (Tabelle 2 und Abb. S1A, B). Das Schlagvolumen und die diastolischen Parameter waren bei mutierten Mäusen im Einklang mit früheren Berichten verringert21. Bei wt-Mäusen führte die ISO-Behandlung im Vergleich zu mutierten Herzen zu einer deutlich stärkeren Abnahme des linksventrikulären Innendurchmessers am Ende der Systole (LVIDs) und des endsystolischen Volumens (ESV). Bei αMHC403/+-Mäusen, die mit ISO behandelt wurden, war die Änderung der Ejektionsfraktion (14 % Anstieg) weniger ausgeprägt als bei Mäusen im Gewicht (22 %, Tabelle 2). Diese Ergebnisse bestätigen, dass das αMHC403/+-Mausherz Schwierigkeiten hat, den erhöhten kontraktilen Anforderungen nachzukommen, die während der Stimulation des sympathischen Nervensystems entstehen.

Um die Wirkung von ISO weiter zu untersuchen, wurden Mäuse 10 Minuten lang mit Atenolol, einem selektiven β1-AR-Antagonisten, vorbehandelt. Eine niedrige Dosis (1 mg/kg, ip) Atenolol reduzierte die Herzfrequenz sowohl bei wt-Mäusen als auch bei αMHC403/+-Mäusen signifikant (Abb. 1I, J, O), aber der Effekt war bei den mutierten Mäusen ausgeprägter (Tabelle 1). Wie erwartet entspannte die selektive β-Blocker-Vorbehandlung auch die linken Ventrikel (Tabelle 2, Abb. S1F,H vs. E,G). ISO erhöhte die Herzfrequenz in Gegenwart von Atenolol sowohl bei wt- als auch bei αMHC403/+-Mäusen (Abb. 1K und Tabelle 1), aber was wichtig ist, blieb die Herzfrequenz bei den mutierten Mäusen, die mit Atenolol behandelt wurden, nach 2 Stunden Erholung nicht erhöht (Tabelle 1). , Abb. 1L,O). Die Verringerung der R-Amplitude und die Zunahme des relativen Auftretens arrhythmischer Ereignisse waren in Gegenwart des β1-AR-Blockers bei αMHC403/+-Mäusen weniger ausgeprägt (Tabelle 1, Abb. 1O). Die Erholung von der In-vivo-ISO-Behandlung, wenn Atenolol vorhanden war, war ähnlich wie bei Wildtiermäusen (Tabelle 1, Abb. 1L, O, S1I, J). αMHC403/+-Mäuse waren ähnlich hellwüchsig, wachsam, mobil und aktiv wie wild lebende Mäuse, wenn sie mit Atenolol und anschließend ISO behandelt wurden. Unsere Daten bestätigen, dass kardiale selektive β1AR-Blocker nicht nur die ventrikuläre Füllung erleichtern, sondern auch die arrhythmogene Aktivität in αMHC403/+-hypertrophen Herzen reduzieren und die Lethargie nach der Stimulation des sympathischen Nervensystems verringern können.

Als nächstes untersuchten wir die AP-Eigenschaften von Herzmuskelzellen, die aus erwachsenen hypertrophen αMHC403/+-Mäusen isoliert wurden, in Abwesenheit und Anwesenheit einer akuten Exposition gegenüber ISO (100 nM). Unter Kontrollbedingungen war das Ruhemembranpotential von αMHC403/+-Myozyten bei 1 Hz leicht depolarisiert und die AP-Dauer signifikant verlängert (APD90: 165,1 ± 12,7 vs. 47,2 ± 4,1; n = 62 bzw. n = 63) (Abb. 2A). –C und Tabelle 3). Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Amplitude des AP festgestellt. In Übereinstimmung damit blieb das Expressionsniveau des kardialen Natriumkanalproteins NaV1.5 in αMHC403/+-Herzen unverändert (Abb. S2). wt-Herzmuskelzellen zeigten keine ausgelöste spontane Automatik, während 88,2 % der αMHC403/+-Herzmuskelzellen eine ausgelöste Aktivität und verzögerte Nachdepolarisationen (DADs) bei niedriger Stimulationsfrequenz (1 Hz) entwickelten (Tabelle 3). Die Exposition gegenüber ISO führte zu einer Verlängerung der Aktionspotentialdauer in Wildkörper-Herzmyozyten (APD50 und APD90, Abb. 2A, Tabelle 3), verkürzte jedoch die αMHC403/+-Myozyten-APD90 (Abb. 2B, C und Tabelle 3). ISO erhöhte auch die Wahrscheinlichkeit von DADs in αMHC403/+-Myozyten signifikant (Abb. 2E, G, Tabelle 3 und Abb. S3).

Repräsentative AP-Aufzeichnungen von wt (A) und αMHC403/+ ventrikulären Myozyten (B), in Abwesenheit (schwarze Linien) oder Anwesenheit von 100 nM ISO (rot). AP-Dauer bei 90 % Repolarisation in Abwesenheit (Gewicht n = 62, N = 21; αMHC403/+ n = 63, N = 19) oder Anwesenheit von Isoproterenol (Gewicht n = 10, N = 7; αMHC403/+ n = 17, N = 5) (C). Repräsentative AP-Zugaufzeichnungen (9 Hz) auf wt (D und F) und αMHC403/+ Herzmuskelzellen (E und G), unter Kontrollbedingungen (D, E) oder in Gegenwart von 100 nM ISO (F, G). Der vergrößerte Bereich zeigt die letzten 3 s der 10 s-Aufzeichnungen. Repräsentative AP-Aufzeichnungen von wt (H) und αMHC403/+ Herzmuskelzellen (I), in Abwesenheit (schwarz) oder Anwesenheit von 10 μM Forskolin (blau). Repräsentative AP-Zugaufzeichnungen unter Kontrollbedingungen (J) oder dem Vorhandensein von 10 μM Forskolin (K) auf αMHC403/+ Herzmuskelzellen. Pfeile zeigen DADs an.

Es ist bekannt, dass die APD von der Herzfrequenz oder der Stimulationsfrequenz abhängt15. Die Stimulation der ventrikulären Myozyten αMHC403/+ mit ihrer Grundfrequenz des Herzschlags (9 Hz oder 540 Schläge/min) zeigte unregelmäßige AP-Muster. Bei der hohen Frequenz waren die Zykluslängen der Impulse kürzer als die ausgelöste APD, was zu einer ineffektiven Repolarisation, frühen Nachdepolarisationen (EADs) und folglich einem depolarisierten Ruhemembranpotential führte (Abb. 2E und Einschub vs. Wt-Kontrolle in Abb. 2D). ISO hatte bei niedriger Stimulationsfrequenz keinen Einfluss auf das Stimulationsmuster (Abb. S3B), aber ein hochfrequenter Stimulus verstärkte die Wirkung von ISO in αMHC403/+-Herzmuskelzellen (Abb. 2G). Darüber hinaus induzierte ISO DADs in den αMHC403/+-Herzmuskelzellen bei allen Stimulationsprotokollen (bei 9 Hz in Abb. 2G vs. F und bei 3 Hz im rechten Feld in Abb. S3A vs. B). Eine lange APD führt auch zu einer langen Refraktärzeit, was zu einer Beeinträchtigung der Impulsleitung und des Wiedereintritts in das Herz führt15. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass ISO die Erregbarkeit und Induktion von Arrhythmien in αMHC403/+-Myozyten erhöhte.

Um die Rolle des β-adrenergen Rezeptorwegs weiter zu untersuchen, verwendeten wir den Adenylylcyclase-Aktivator Forskolin und zeichneten Änderungen der AP-Konfiguration während der Stromklemme auf. Die DAD-Frequenz erhöhte sich in stromgeklemmten Herzmuskelzellen (1,158 ± 0,313 gegenüber 0,270 ± 0,073, Tabelle 3 und Abb. 2J, K) und veränderte die AP-Eigenschaften im Vergleich zu ISO (Abb. 2H, I und Tabelle 3). Sowohl Forskolin als auch ISO verkürzten den AP in αMHC403/+-Myozyten, aber Forskolin erhöhte auch den APD50 signifikant (Abb. 2I). Isoproterenol veränderte die APD50 nicht, verkürzte jedoch die APD90, was auf einen vorherrschenden Effekt auf die Repolarisation hinweist (Phase 3).

Um zu bestätigen, dass ISO die Anfälligkeit für Arrhythmien in αMHC403/+ ventrikulären Myozyten über Proteinkinase A erhöht, haben wir die Zellen 30 Minuten lang mit einem zelldurchlässigen Proteinkinase-A-Inhibitor PKI (myristoyliertes PKI 14–22 Amid, Tocris) vorbehandelt. 3 μM PKI schwächte die arrhythmogene Wirkung von ISO und die DAD-Häufigkeit in αMHC403/+-Myozyten in Gegenwart von 100 nM ISO ab (0,216 ± 0,116 + PKI vs. 0,525 ± 0,0192 p < 0,05 Tabelle 3). Isoproterenol verkürzte in Gegenwart des Proteinkinase-A-Inhibitors die APD nur geringfügig (Tabelle 3). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch die β-adrenerge Signalkaskade aktivierte PKA-Phosphorylierung für die erhöhte arrhythmische Aktivität in mutierten ventrikulären Myozyten verantwortlich ist.

Die Bildung von Arrhythmien in Herzmuskelzellen von Mäusen kann als Folge von Veränderungen der Kalium- oder Kalziumströme auftreten22. In prähypertrophen αMHC403/+-Herzmuskelzellen wurde bereits über eine signifikante Abnahme der Ito-, IKslow- und Isust-Komponenten repolarisierender Kaliumströme berichtet18. In dieser Studie haben wir einen Rückgang der Ipeak-, Ito-, IKslow- und Isust-Komponenten der repolarisierenden Kaliumströme in linksventrikulären Myozyten aufgezeichnet, die aus hypertrophen Herzen isoliert wurden (Abb. 3A vs. B, F vs. E). Entsprechend den elektrophysiologischen Veränderungen wurden in αMHC403/+-Herzen im Vergleich zu wt-Herzen signifikant verringerte Expressionsniveaus der Kanalproteine ​​KV4.2, Kir2.1 und Kir6.2 festgestellt. Die Lokalisierung des ATP-sensitiven K+-Kanals Kir6.2 war auch in αMHC403/+-Myozyten verändert (Abb. 3G). Die Expression und Lokalisierung anderer Kaliumkanalproteine: KV1.4, KV1.5, KV2.1, KV11.1 und KV7.1 oder ihrer Hilfsuntereinheitsproteine ​​TASK1 und KCNE1/MinK waren in αMHC403/+-Herzen nicht signifikant verändert (Abb. S2).

Repräsentative Kaliumstromaufzeichnungen von wt- (A, C) und αMHC403/+ (B, D) ventrikulären Myozyten unter Kontrollbedingungen (A, B) oder der Anwesenheit von 100 nM ISO (C, D). Als Reaktion auf 500 ms lange depolarisierende Spannungsschritte wurden spannungsgesteuerte, nach außen gerichtete K+ (KV)-Ströme der gesamten Zelle hervorgerufen, um Potentiale zwischen – 60 und + 40 mV in Schritten von 10 mV von einem Haltepotential von – 70 mV (– 70 mV) zu testen. 0 mV und positive Testpotentiale dargestellt). Nach innen gerichtete gleichrichtende K+-Ströme (IK1), die als Reaktion auf eine Hyperpolarisierung auf –120 mV hervorgerufen werden. (E–F) Streudiagramm mit Balkendiagrammen zeigt IK-Dichtewerte (pA/pF) für verschiedene KV-Stromkomponenten als Mittelwert ± SEM. Gew. n = 8–15, N = 5 αMHC403/+ n = 10–16 N = 5*p < 0,05 Kontrolle im Vergleich zu ISO, †p < 0,05 Gew. im Vergleich zu αMHC403/+ (G) Repräsentative Immunfluoreszenz und entsprechende Western-Blot-Bilder für KV4 .2, Kir2.1, Kir6.2 Kaliumkanäle aus wt- und αMHC403/+-Herzen wie angegeben. Die Werte der relativen optischen Dichte (Rel OD) wurden unter Verwendung von VDAC (spannungsabhängiger Anionenkanal) als Ladungskontrolle berechnet. Weitere Einzelheiten finden Sie im Abschnitt „Materialien und Methoden“.

Interessanterweise zeigten αMHC403/+ Herzmuskelzellen einen signifikanten Anstieg der Empfindlichkeit von Ito- und IKslow-Strömen auf 100 nM ISO (Abb. 3D, F) im Vergleich zu Wildkörper-Myozyten (Abb. 3C, E). Eine verringerte Repolarisationsreserve und eine erhöhte Empfindlichkeit von Ito und IKslow gegenüber ISO können zur APD-Verkürzung beitragen, die in αMHC403/+-Herzmuskelzellen beobachtet wird (Abb. 2B, C). Dennoch würde dies nur teilweise die erhöhte Arrhythmogenität während der sympathischen Aktivierung erklären.

Es ist allgemein bekannt, dass sich Synapse Associated Protein 97 (SAP97) gemeinsam mit Kir2- und KV-Kanalproteinen lokalisiert, diese an der Plasmamembran verankert und die korrekte Faltung und Funktion unterstützt23. Zusätzlich zu den AKAP-Proteinen ist SAP97 an der Lokalisierung des β1-adrenergen Rezeptors und der PKA-Phosphorylierung beteiligt24. Wir haben eine signifikante Abnahme der SAP97-Proteinexpression in Herzgewebe und Myozyten gemessen, die aus αMHC403/+-Mäusen im Vergleich zu Wildtiermäusen isoliert wurden (Abb. 4). Darüber hinaus zeigte die konfokale Bildgebung Unterschiede in der Lokalisierung des SAP97-Proteins mit einer relativ erhaltenen Oberflächenmembranpräsentation des Proteins und einem verringerten intrazellulären SAP97-Gehalt. Unsere Daten (Abb. 3G, 4) stimmen mit Veränderungen der Zellgröße und der Myofilamentorganisation überein, die charakteristisch sind, wenn strukturelle Veränderungen wie Hypertrophie vorliegen. Wir haben einen deutlichen Rückgang (~ 40 %) der Connexin-43-Proteinexpression in αMHC403/+-Herzen gemessen (Abb. 4). Dies trägt wahrscheinlich zu einer veränderten Leitfähigkeit bei, die zu einer Heterogenität der Impulsausbreitung führt, die in Kombination mit einer verringerten Repolarisation und einem beeinträchtigten Kalziumtransport ein Substrat für Wiedereintrittsarrhythmien darstellt15,22. Über einen veränderten Umgang mit Kalzium im αMHC403/+-Modell wurde als Folge eines verringerten SR-Kalziumgehalts und einer Kalziumakkumulation durch mutierte Myofilamente berichtet11,16,21. Allerdings sind die systolischen und diastolischen Calciumkonzentrationen, die in wt- und hypertrophen αMHC403/+-Herzen gemessen werden, ähnlich17. In Übereinstimmung mit unseren früheren Erkenntnissen7 zeigten ruhende erwachsene αMHC403/+-Herzmuskelzellen in Abwesenheit von ISO eine kleine, aber signifikante Abnahme der Kinetik der Kalziumstrominaktivierung (Abb. 5B vs. 5A und E) des L-Typ-Kalziumkanals (ICa), ohne Änderung der Spitzenamplitude (Abb. 5A, B), der Stromdichte (Abb. 5D), Aktivierung oder Deaktivierung, bewertet als Integral des Stroms (Abb. S4A – C). Wie erwartet war die Zellkapazität in αMHC403/+-Myozyten erhöht, was mit einem hypertrophen Phänotyp übereinstimmt (Abb. 5C). Immunoblot-Studien zeigten, dass es keinen signifikanten Unterschied in der CaV1.2-Proteinexpression in Herzhomogenaten von αMHC403/+ gegenüber Wildtiermäusen gab (Abb. 5F).

Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von ventrikulären Myozyten, die aus wt- und αMHC403/+-Herzen isoliert und mit Connexin 43, Caveolin-3 und SAP97 immunmarkiert wurden. Die Skala entspricht 20 μm. Für dieselben Proteine ​​werden auch repräsentative Western-Blot-Bilder mit Werten der relativen optischen Dichte sowie entsprechende Beladungskontrollen angezeigt. *p < 0,05 Gew. vs. αMHC403/+. Weitere Einzelheiten finden Sie im Abschnitt „Materialien und Methoden“.

Repräsentative Calciumstromaufzeichnungen und IV-Spuren von wt (A) und αMHC403/+ (B) ventrikulären Myozyten unter Kontrollbedingungen (schwarze Linien) oder bei Vorhandensein von ISO (rot). Streudiagramme mit Balkendiagrammen zeigen die Zellkapazität (C), die zur Berechnung der ICa-Dichte (pA/pF) (D) verwendet wird; und (E) die Inaktivierungsrate (Tau). Anzahl der für die Studie verwendeten Zellen: wt n = 26, mit ISO n = 13; αMHC403/+ n = 42, mit ISO n = 22. (F) Repräsentative Western-Blot-Bilder des CaV1.2-Proteins unter Verwendung von Gesamtherzhomogenaten aus wt (N = 5) und αMHC403/+ Herzen (N = 4), dreifach wiederholt. (G) In-vitro-PKA-phosphorylierte immunpräzipitierte Proteinproben wurden verwendet, um das gesamte Phosphoprotein sowie die PKA-spezifische Phosphorylierung fluoreszierend nachzuweisen. (H, I) Repräsentative Fluo-4-Kalziumtransienten, die an stromgeklemmten ventrikulären Myozyten erfasst wurden, die aus Wildtier- (H) und αMHC403/+-Mäusen (I) unter Kontrollbedingungen isoliert wurden (schwarze Spuren, n = 23, N = 5; und n = 18). , N = 5) oder das Vorhandensein von 100 nM ISO (rote Spuren, (n = 13, N = 5; bzw. n = 11, N = 5). Streudiagramme mit Balkendiagrammen zeigen die relative Amplitude (als F/F0). , J), exponentielle Anstiegszeit (ms) (K) und exponentieller Abfall (tau) (L). (M–N) Repräsentative Calciumstromaufzeichnungen von wt (M) und αMHC403/+ (N) Herzmuskelzellen unter Kontrollbedingungen ( schwarz) oder das Vorhandensein von 10 μM Forskolin (blau). Streudiagramme mit Balkendiagrammen zeigen die ICa-Dichte (pA/pF) (O); und die Inaktivierungsrate (tau) von ICa-Spuren (P), dargestellt als Mittelwert ± SEM * p < 0,05 Kontrolle gegenüber ISO oder wt gegenüber αMHC403/+, Anzahl der Sternchen stellt zunehmende Signifikanz im p-Wert dar. Anzahl der verwendeten Zellen: wt n = 30 Strg, n = 6 mit Forskolin und αMHC403/+ n = 45 Strg, n = 10 mit Forskolin.

Überraschenderweise hatte die akute ISO-Exposition (100 nM) jedoch keinen Einfluss auf die Stromdichte (Abb. 5D) und die Aktivierungs- oder Deaktivierungsparameter von ICa in αMHC403/+ (Abb. S4A–C), obwohl sie den ICa in Wildkörper-Herzmuskelzellen erheblich erhöhte (Abb. 5D,E, S4A–C). Unter stimulierten Bedingungen (1 Hz) wurde in Übereinstimmung mit früheren Berichten kein signifikanter Unterschied in den Calciumtransienten zwischen αMHC403/+ und Wildkörper-Myozyten festgestellt (Abb. 5H–L)17. In Gegenwart von 100 nM ISO war die Spitzenamplitude des Calciumtransienten jedoch nur in Wildkörper-Myozyten signifikant erhöht (Abb. 5H, J). Wir untersuchten die Phosphorylierungsniveaus des immunpräzipitierten CaV1.2-Proteins und fanden eine erhöhte Grundphosphorylierung in αMHC403/+-Herzen. Die Exposition des immunpräzipitierten CaV1.2 gegenüber PKA erhöhte den Phosphorylierungsgrad des CaV1.2-Kanals in wt-, aber nicht in αMHC403/+-Herzen (Abb. 5G), was darauf hindeutet, dass das CaV1.2-Protein in αMHC403/+-Herzen unter Basal bereits signifikant phosphoryliert war Bedingungen. Dies stand im Einklang mit der fehlenden Reaktion von ICa auf ISO in αMHC403-Myozyten.

Elektrophysiologische In-vitro- und biochemische Ex-vivo-Studien zeigten keinen Unterschied in der CaV1.2- (Abb. 5F) und der β1-adrenergen Rezeptorexpression (Abb. S2) oder dem basalen Calciumstrom in αMHC403/+-Herzen im Vergleich zu wt-Herzen unter Kontrollbedingungen (Abb. 5A). ,B,D). Jüngste Studien haben eine Superclusterung von CaV1.2 gezeigt, die durch die Stimulation des β1-adrenergen Rezeptors in Herzmuskelzellen von Mäusen gefördert wird25. Um eine mögliche Rolle für veränderte Kanalclusterung und CaV1.2-β1-AR-Kolokalisation zu untersuchen, führten wir Experimente mit hochauflösender Mikroskopie durch.

Die Vorbehandlung mit ISO (100 nM Isoproterenol, 10 Min.) führte zu einem signifikanten Anstieg der Bildung von CaV1.2-Superclustern in wt, jedoch nicht in αMHC403/+-Myozyten (Abb. 6)). Während sich die β1-AR-Clusterfläche in αMHC403/+-Herzmyozyten im Vergleich zu Wildkörper-Myozyten unter Kontrollbedingungen nicht signifikant unterschied (Abb. 7A, C, E), veränderte die ISO-Behandlung die Größe der β1AR-Clusterfläche in αMHC403/+ signifikant, nicht jedoch in Wildkörperzellen Myozyten (Abb. 7B,D,E).

ISO-induzierte Superclustering-Reaktion von CaV1.2 in ventrikulären Myozyten. (A–B) TIRF-Bilder (obere Reihe) und hochauflösende GSD-Lokalisierungskarten (untere Reihe) von immungefärbten CaV1.2-Kanälen in fixierten adulten ventrikulären Myozyten, die aus Wildtier- (A) und αMHC403/+-Mäusen (B) isoliert wurden. Zum Vergleich werden Kontroll- (linke Spalte) und ISO-stimulierte (rechte Spalte) Myozyten nebeneinander angezeigt. Cluster-ROIs, die in den GSD-Bildern durch gelbe Kästchen gekennzeichnet sind, erscheinen vergrößert unter dem relevanten Bild (untere Reihe). Die mittleren CaV1.2-Kanalclusterflächen ± SEM (angezeigt durch rote Linien und Fehlerbalken) werden für jede Bedingung im ausgerichteten Punktdiagramm (C) zusammengefasst. *p < 0,05 für Vergleiche wie angegeben. n = 14–27 ventrikuläre Myozyten, von N = 4–7 Mäusen.

Die Kolokalisierung von β1ΑRs mit CaV1.2 ist in αMHC403/+-mutierten Myozyten verändert. (A) und (B): TIRF-Bilder (obere Reihe), hochauflösende GSD-Lokalisierungskarten (mittlere Reihe) und binarisierte Bilder (untere Reihe) von immungefärbten CaV1.2-Kanälen und β1ARs in repräsentativen fixierten adulten ventrikulären Myozyten, die aus WT-Mäusen isoliert wurden unter kontrollierten (A) oder ISO-stimulierten Bedingungen (B). Das zusammengeführte Zweikanalbild, das die relativen Verteilungen von CaV1.2 und β1ARs zeigt, wird in der dritten Spalte mit dem kolokalisierten binarisierten Bild angezeigt. (C, D) Gleiches Layoutformat für Myozyten, die aus αMHC403/+-Mäusen isoliert wurden. (E) Die mittleren β1ARs-Clusterflächen ± SEM (angezeigt durch rote Linien und Fehlerbalken) werden für jede Bedingung im ausgerichteten Punktdiagramm zusammengefasst. (F) % Kolokalisierung von CaV1.2 mit β1ARs und G: β1ARs und CaV1.2 werden zusammengefasst. *p < 0,05 für Vergleiche wie angegeben. n = 14–27 ventrikuläre Myozyten, von N = 4–7 Mäusen.

Die Kolokalisierungsanalyse von αMHC403/+ und Wildkörper-Herzmuskelzellen, die mit CaV1.2- und β1AR-Antikörpern markiert waren, ergab eine relativ kleine Anzahl von CaV1.2, die mit β1ARs in Körperzellen-Herzmuskelzellen kolokalisiert waren, und einen signifikant höheren Anteil von CaV1.2, der mit β1ARs in αMHC403/ kolokalisierte. + Myozyten unter Kontrollbedingungen (Abb. 7A–D,F). Die ISO-Behandlung führte dazu, dass mehr CaV1.2-Protein mit β1ARs in Wildkörper-Herzmyozyten kolokalisierte, aber unter den gleichen Bedingungen wurde festgestellt, dass vergleichsweise weniger CaV1.2 mit β1ARs in αMHC403/+-Myozyten lokalisiert war (Abb. 7A – D, F). Die Kolokalisierung von CaV1.2 mit dem β1AR könnte den höheren Phosphorylierungsgrad des Kanalproteins in αMHC403/+-Herzmuskelzellen erklären (Abb. 5G). Es gab keine Veränderung bei der gemeinsamen Lokalisierung von β1AR mit CaV1.2 (Abb. 7A – D, G).

Frühere Studien haben gezeigt, dass Caveolin-3 eine Rolle bei der Bildung makromolekularer Komplexe mit β-adrenergen Rezeptoren und bei der β-adrenergen Signalübertragung spielt26,27. Obwohl αMHC403/+-Myozyten im Vergleich zu Wildkörper-Myozyten eine verringerte Caveolin-3-Expression aufwiesen (die statistisch nicht signifikant war (Abb. 4), wurden keine Veränderungen im Clusterbereich oder eine Kolokalisierung mit CaV1.2-Protein beobachtet (Abb. S5).

Unsere Super-Resolution-Studie zeigte, dass die Lokalisierung des CaV1.2-Proteins und des β-adrenergen Rezeptors in αMHC403/+-Myozyten verändert ist. Um die veränderte Co-Lokalisierung von CaV1.2-β1AR weiter zu bestätigen, untersuchten wir die Wirkung von Forskolin auf ICa. Im Gegensatz zur fehlenden Reaktion auf ISO erhöhte die Zugabe von 10 µM Forskolin die Amplitude, Aktivierung und Inaktivierung von ICa in αMHC403/+-Myozyten ähnlich wie bei Wildkörper-Myozyten (Abb. 5M–P, S4D–F). Diese Daten deuten darauf hin, dass ein veränderter Ionenkanal und eine veränderte β1AR-Lokalisierung für den veränderten Kalziumtransport in αMHC403/+-Myozyten verantwortlich sind.

Um die Mechanismen für die schlechte Erholung von αMHC403/+-Mäusen nach einer ISO-Behandlung weiter zu untersuchen, wurden nach einer In-vivo-Isoproterenol-Exposition Herzen entnommen und die Phosphorylierung von CaV1.2 bewertet. Unbehandelte αMHC403/+-Mäuseherzen zeigten im Vergleich zu Wildkörpern eine Phosphorylierung sowohl von CaV1.2 als auch des Gesamtproteins, die nach der ISO-Behandlung unverändert blieb (Abb. S6A–C). Diese Daten legen nahe, dass CaV1.2 unter Kontrollbedingungen in αMHC403/+-Mäusen phosphoryliert wird. Die Aktivität der Kreatinkinase (CK) war auch in den Herzen von ISO-behandelten αMHC403/+-Mäusen im Vergleich zu wt-Mäusen signifikant erhöht, was auf eine anhaltende Myokardschädigung hindeutet (Abb. S6D).

Die hypertrophe Kardiomyopathie ist durch eine Desorganisation der Proteine ​​des Zytoskeletts und der Myofibrillen, eine Umgestaltung der Myozyten, eine Fibrose und einen veränderten Energiestoffwechsel gekennzeichnet10. Wir und andere haben gezeigt, dass αMHC403/+-Mäuse klinische Merkmale entwickeln, die denen ähneln, die bei Erkrankungen des Menschen sowohl auf zellulärer als auch auf der Ebene des gesamten Herzens auftreten.7,21. Veränderungen der elektrischen Eigenschaften des Herzmuskels, die als Reaktion auf Stressfaktoren wie eine erhöhte adrenerge Stimulation auftreten, können zur Entstehung ventrikulärer Arrhythmien beitragen und zum plötzlichen Herztod führen9. Ziel dieser Studie war es, die Mechanismen für eine erhöhte arrhythmogene Aktivität zu untersuchen, die aus der Mutation der menschlichen FHC-Krankheit während der sympathischen Stimulation resultiert.

Unsere Daten deuten darauf hin, dass die AP-Eigenschaften in αMHC403/+-Myozyten signifikant verlängert waren und sich im Gegensatz zu den Reaktionen in Wildkörperzellen unter Bedingungen erhöhter adrenerger Stimulation verkürzten. Bei normaler muriner Herzschlagfrequenz (9 Hz) in Gegenwart von ISO war die Membranrepolarisation in αMHC403/+-Myozyten unvollständig, das Ruhemembranpotential wurde stärker depolarisiert, was zu früheren und verzögerten Nachdepolarisationen führte. Darüber hinaus war die AP-Refraktärzeit verlängert, was ein anerkannter Grund für die beeinträchtigte Impulsleitung und den Wiedereintritt in das Herz ist15.

Der offensichtlichste Unterschied zwischen der AP-Kinetik von Mensch und Maus besteht in der Plateauphase. Im Mausherz ist die depolarisierende ICa weniger ausgeprägt, während die repolarisierende Ito und IKur stärker ausgeprägt sind, und als Folge davon zeigen murinen APs eine schnellere Repolarisation. Dennoch können Ähnlichkeiten in der Struktur, der Erregungs-Kontraktions-Kopplung, der Wiederherstellung und Ausbreitung der Erregung auf molekularer, zellulärer, Gewebe-, Organ- und Gesamttierebene in der Maus untersucht werden22,28. Um etwaige Unterschiede in den APs zwischen Maus und Mensch zu klären, führten wir zusätzliche Experimente durch und bewerteten die AP-Eigenschaften von hiPSC-CMs (siehe SI-Methoden) eines Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie, der die R403Q-MYH7-Mutation trug (MYH7 403/+, siehe Familienstammbaum, Abb. S7C). Aktionspotenzialmessungen wurden mit der Plattform der kinetischen Bildgebungszytometrie (KIC) durchgeführt. Ähnlich wie bei den mutierten Myozyten der Maus war die AP-Dauer von MYH7 403/+ im Vergleich zur isogenen CRISPR-korrigierten Kontrolle MYH7 403/− (Abb. S7A, D, F) signifikant verlängert (Abb. S7B, E, F). Ähnlich wie bei den αMHC403/+-Myozyten verkürzte die Anwendung von 1 µM ISO die AP-Dauer von MYH7 403/+ deutlich, während ISO die AP-Dauer der isogenen CRISPR-korrigierten Kontrolle leicht verlängerte. Daher ähneln die Veränderungen des Aktionspotentials in hiPSC-CMs denen von αMHC403/+-Myozyten, und bei FHC kommt es früh zu einer elektrischen Umgestaltung auf der Ebene der Herzmuskelzellen. Dies wird durch eine hohe Inzidenz von Arrhythmien und plötzlichem Herztod bei mutierten kardialen Troponin-T-Mäusen (TnT-I79N) berichtet, wenn kein hypertropher Phänotyp vorliegt. Die Einführung der TnT-I79N-Mutation in humane induzierte pluripotente Stammzellen mithilfe der CRISPR/Cas9-Technik reproduzierte Schlüsselmerkmale von FHC, darunter Myofilament-Unordnung, Hyperkontraktilität und diastolische Dysfunktion sowie Veränderungen im ventrikulären AP29. Die vorgeschlagenen Mechanismen unterscheiden sich jedoch häufig zwischen bestimmten Mutationen. Im TNNT2-R92Q-Mausmodell30 tragen eine Abnahme von NaV1.5 und eine Zunahme der CaV1.2-Expression sowie des späten Natriumstroms (INaL) zum Phänotyp bei. Isoproterenol verlängert die AP zusätzlich. In unserem Modell fanden wir keinen Unterschied in der NaV1.5- oder CaV1.2-Expression und Isoproterenol verkürzte die AP-Dauer.

Zusätzlich zu einer Abnahme der Expression und Funktion einiger Kaliumkanäle berichten wir hier über einen Anstieg der Empfindlichkeit von Ito und IKslow gegenüber ISO, der offenbar zur APD-Verkürzung bei αMHC403/+-Herzmuskelzellen beitrug. Die SAP97-Proteinexpression war in mutierten Herzen verringert, was mit einer Veränderung im Transport und der Lokalisierung von K+-Kanälen einhergeht. Das SAP97-Protein ist auch im β1-adrenergen Signalkomplex lokalisiert. Wichtig ist, dass wir einen erheblichen Rückgang der Connexin-43-Proteinexpression nachwiesen, der mit morphologischen und histologischen Veränderungen im hypertrophen Myokard korreliert. Dies kann zu einer beeinträchtigten Impulsleitung führen, was zu einer Heterogenität der Impulsausbreitung führt15,22.

In Übereinstimmung mit früheren Studien fanden wir keinen Unterschied im diastolischen oder systolischen intrazellulären Kalziumspiegel in αMHC403/+-Myozyten oder in der CaV1.2-Expression im Vergleich zu Wildkörperherzen7,17. Trotz des kleinen, aber signifikanten Unterschieds in der Inaktivierungsrate der Kanal- und Calciumtransienten konnten wir den Cav1.2-Strom nicht erhöhen, wenn αMHC403/+-Myozyten einer β1-adrenergen Stimulation ausgesetzt wurden. In Übereinstimmung damit zeigten wir einen erhöhten Phosphorylierungszustand des CaV1.2-Kanalproteins, das aus kardiomyopathischen αMHC403/+-Mäusen extrahiert wurde. Wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass eine veränderte Phosphataseaktivität zum erhöhten Phosphorylierungszustand des Kanals beiträgt.

Es ist gut dokumentiert, dass die β1-adrenerge Stimulation die Aktivität des kardialen L-Typ-Kalziumkanals steigert. Um das kooperative Gating zu erleichtern, bilden die CaV1.2-Moleküle Supercluster25. Anhand hochauflösender Mikroskopie zeigen wir, dass CaV1.2-Proteine ​​in ventrikulären Myozyten, die aus hypertrophen αMHC403/+-Herzen isoliert wurden, Cluster bilden, ähnlich wie Wildkörperzellen, aber die Behandlung mit Isoproterenol erhöhte die Größe dieser Cluster nur in Wildkörper-Herzmyozyten signifikant. Die CaV1.2-Moleküle gruppierten sich nicht nur unterschiedlich, sondern es waren auch mehr CaV1.2 zusammen mit β1ARs in mutierten Myozyten lokalisiert. Dies zeigt zum ersten Mal eine direkte Interaktion zwischen CaV1.2 und β1ARs, was den höheren Phosphorylierungsgrad des Kanalproteins in αMHC403/+ Herzmuskelzellen erklären kann. Die In-vitro-ISO-Behandlung stimulierte die Kolokalisierung von CaV1.2 und β1ARs in Wildkörper-Herzmyozyten, verringerte jedoch in αMHC403/+-Myozyten die Anzahl der mit β1ARs lokalisierten CaV1.2.

Hier zeigen wir, dass die β-adrenerge Stimulation allein ausreicht, um die Wahrscheinlichkeit einer arrhythmischen Aktivität bei αMHC403/+-Mäusen zu erhöhen. Hypertrophe Herzen der αMHC403/+-Mäuse zeigten nicht nur ISO-induzierte Arrhythmien, sondern die Mäuse erholten sich auch nicht gut von der ISO-Belastung, was zu Müdigkeit und Gewebeschäden führte, die als signifikanter Anstieg der Kreatinkinaseaktivität in den αMHC403/+-Herzen beurteilt wurden, jedoch nicht wt Herzen. Berichten zufolge leiden FHC-Patienten nach intensiver körperlicher Betätigung unter schweren kardiovaskulären Ereignissen und Müdigkeit12.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Unordnung des Zytoskeletts zu den Veränderungen der Lokalisierung und Funktion des Ionenkanals und des β1-adrenergen Rezeptors im αMHC403/+-Herzen beiträgt. Eine verringerte Repolarisationsreserve und eine veränderte Leitungsgeschwindigkeit sind mit der Entstehung von Arrhythmien während der Stimulation des β1-adrenergen Rezeptors im αMHC403/+-Herzen verbunden. Die proarrhythmischen Mechanismen können jedoch abhängig von der zugrunde liegenden Genmutation variieren, was die Notwendigkeit verstärkt, die Behandlungsoptionen anhand der genetischen Mutation zu individualisieren. Wir stellen fest, dass die Hemmung des β1AR mit Atenolol die Ventrikelmuskulatur entspannte und die Füllung verbesserte, aber auch das Auftreten arrhythmischer Ereignisse deutlich reduzierte und es den Mäusen ermöglichte, sich vollständig von der adrenergen Belastung zu erholen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass eine Behandlung mit selektiven β1AR-Blockern zur Behandlung von Arrhythmien bei Patienten mit einer R403Q-Mutation ausreichend sein kann. Darüber hinaus betonen wir die Bedeutung der Zytoskelettstörung bei der Veränderung der Position und Funktion von Ionenkanälen sowie der Signalübertragung des β-adrenergen Rezeptors, was zu elektrischer Instabilität im FHC-Herzen führt.

Es wurden männliche, 35–45 Wochen alte heterozygote αMHC403/+-Mäuse verwendet, die die beim Menschen krankheitsverursachende Mutation R403Q in MYH6 exprimierten. Wir haben männliche Mäuse verwendet, da weibliche Mäuse, die die αMHCR403Q/+-Mutation tragen, weniger konsistent eine hypertrophe Kardiomyopathie entwickeln als männliche. Mäuse wurden verwendet, um eine Kolonie zu gründen, die sie als Geschenk von C und J Seidman (Abteilung für Genetik, Harvard Medical School, MA) erhalten hatten. Als Wildtyp-Kontrollen (wt) wurden negativ genotypisierte, altersentsprechende männliche Wurfgeschwister verwendet. In der Studie wurden insgesamt 68 Wild- und 92 αMHC403/+-Mäuse verwendet. Im Text gibt N die Anzahl der Tiere an, n die Anzahl der Zellen.

Alle Experimente wurden von der Tierethikkommission der University of Western Australia in Übereinstimmung mit dem Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NHMRC, 8. Auflage, 2013; aktualisiert 2021) genehmigt und alle Methoden wurden entsprechend gemeldet mit den ARRIVE-Richtlinien.

Mäuse wurden mit Methoxyfluran anästhesiert und auf eine Wärmeplatte (37 °C) gelegt. Elektrokardiogramme (EKGs) wurden mit sc bipolaren Ableitungen (Ableitung II) unter Verwendung eines PowerLab-Datenerfassungssystems mit Animal BioAmp für 10 Minuten vor (Kontrolle) und nach ip Isoproterenol (ISO, zwei Dosen von 20 mg/kg im Abstand von 10 Minuten verabreicht) aufgezeichnet. oder Atenolol (1 mg/kg). Die Parameter wurden an signalgemittelten Komplexen gemessen, die aus 10 s zusammenhängenden Daten abgeleitet wurden. Das QT-Intervall wurde anhand der Mitchell-Methode31 um die Herzfrequenz korrigiert. Das relative Auftreten arrhythmischer Ereignisse wurde als Anzahl unregelmäßiger Schläge pro Sekunde der Aufzeichnung gemessen (LabChart ADInstruments).

In parallelen Experimenten wurden Echokardiogramme mit der i13L-Sonde auf einem Vivid 7 Dimension (GE Healthcare) aufgezeichnet, wie zuvor beschrieben32.

Linksventrikuläre Herzmuskelzellen wurden wie beschrieben isoliert32, weitere Einzelheiten siehe SI. Die Zellen wurden im Current-Clamp-Modus bei 1, 3 oder 9 Hz mit 0,2 ms überschwelligen Reizen stimuliert. Glaspipetten (4–5 MΩ) wurden mit Pipettenlösung (in mM) gefüllt: 120 K-Glutamat, 20 KCl, 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,1 EGTA, 5 Hepes, 5 MgATP, 0,03 CaCl2, pH 7,05. Die Experimente wurden bei 37 °C in Tyrode-Lösung (in mM) durchgeführt: 140 NaCl, 5,4 KCl, 1 CaCl2, 0,5 MgCl2, 5,5 Hepes, 11 Glucose, pH 7,4 bei Raumtemperatur. Die AP-Dauer wurde bei 90 % (APD90) und 50 % (APD50) der Repolarisation gemessen.

Zur Aufzeichnung der K+-Ströme ganzer Zellen wurden Pipetten mit AP-Aufzeichnungspipettenlösung gefüllt. Die Badlösung enthielt (in mM): 136 NaCl, 4 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 Hepes, 10 Glucose, 0,02 Tetrodotoxin (TTX, Tocris), 0,002 Nisoldipin, pH 7,4. Spannungsgesteuerte K+-Ströme für die ganze Zelle waren hervorgerufen als Reaktion auf 500 ms dauernde depolarisierende Spannungsschritte auf Testpotentiale von – 120 mV und zwischen – 60 und + 40 mV (Schritte von 10 mV) ab einem Haltepotential von – 70 mV. Die Experimente wurden bei 37 °C durchgeführt. Der KV-Spitzenstrom und die IK1-Amplituden wurden als maximale Amplituden der Ströme gemessen. Die Ito-Amplitude wurde durch exponentielle Anpassung an die Abklingphase des nach außen gerichteten K+-Stroms bestimmt, die Isustained-Komponente als Stromamplitude am Ende des Testimpulses und IK,slow wurde als Differenz zwischen Ito und Isustained18 berechnet.

Ca2+-Ströme wurden in Badlösung (in mM) aufgezeichnet: 140 NaCl, 5,4 CsCl, 1 CaCl2, 0,5 MgCl2, 5,5 HEPES, 11 Glucose, pH 7,4 bei 37 °C, wie zuvor beschrieben32. Pipettenlösung enthalten (in mM): 115 CsCl, 1 CaCl2, 20 TEA-Cl, 10 HEPES, 10 EGTA, 5 MgATP, 0,1 Tris-GTP, 10 Phosphokreatin, pH7,05. Ca2+-Ströme wurden überwacht, indem alle 10 s ein 100 ms langer Testimpuls auf 10 mV nach einem 50 ms langen Vorimpuls auf –30 mV angelegt wurde. Die Kinetik der Inaktivierung des Kalziumstroms wurde analysiert, indem der Stromabfall nach der Kanalaktivierung mit einer biexponentiellen Funktion angepasst wurde (was Tau 1 und Tau 2 ergab). Die aktuelle Aktivierung und Inaktivierung wurde auch durch Berechnung des Integrals oder der „Fläche unter einer Kurve“ als Fläche zwischen dem Diagramm von y = f(x) und der x-Achse bewertet.

Sowohl APs als auch Ganzzellströme wurden mit einem Axopatch 200B-Voltage-Clamp-Verstärker (Molecular Devices) und einem IBM-kompatiblen Computer mit einer Digidata 1400-Schnittstelle und pClamp10-Software (Molecular Devices) aufgezeichnet. Aus demselben Tier isolierte Herzmuskelzellen wurden für AP- und Ca2+- oder K+-Strommessungen verwendet. Datenanalysen wurden mit Clampfit10 und GraphPad Prism8 durchgeführt, die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angegeben.

Das Gewebe wurde gewogen und in 1:4 RIPA-Puffer homogenisiert, bestehend aus (in mM): 150 NaCl, 50 Tris, 20 Na4P2O7, 2 Na3VO4, 1 NaF, 0,5 % Na-Desoxycholat, 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, EDTA-freier kompletter Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche) und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail, pH 7,4. Das Homogenat wurde 5 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 g zentrifugiert. 25 μg gepooltes Gewebehomogenat (N = 3 Gew.-% und 3 αMHC403/+-Herzen) wurden in vorgefertigtes 10 % Bio-Rad Mini-Protean TGX Stain-FreeTM SDS-Polyacrylamidgel geladen und dann elektrophoretisch auf eine 0,2 μm Nitrozellulosemembran übertragen (Trans- Blot TurboTM Transfer Pack (Bio-Rad) unter Verwendung des Bio-Rad Trans-Blot TurboTM Transfersystems. Western-Blot-Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, repräsentative Bilder sind in den Abbildungen dargestellt. Die in der Studie verwendeten Antikörper sind in SI aufgeführt. Die Densitometrie wurde mit durchgeführt ImageJ-Software. Die vom Hintergrund subtrahierten Intensitätswerte wurden auf das VDAC- oder GAPDH-Signal der Ladekontrollen auf demselben Blot normalisiert. Weitere Einzelheiten und Blots in voller Länge finden Sie in SI.

Mit Dynabeads Protein G (Thermo Fisher Scientific) vorinkubierter Anti-CaV1.2-Antikörper, der zur Extraktion des CaV1.2-Proteins aus Gewebehomogenaten verwendet wird. Pro μg immunpräzipitiertem Protein wurden 2 Einheiten der katalytischen PKA-Untereinheit (Promega) verwendet, um die In-vitro-Phosphorylierung wie zuvor beschrieben durchzuführen33. Alle Immunblot-Experimente wurden dreifach durchgeführt, repräsentative Bilder wurden auf den Abbildungen gezeigt. Für weitere Details und Original-Blots siehe SI.

Präzisionsdeckglas (Nr. 1.5H, Marienfeld Superior), gereinigt und dann mit Poly-L-Lysin (0,01 %, 20 Min.) und Laminin (20 μg/ml, 45 Min.; Life Technologies) beschichtet.

Für die konfokale Mikroskopie wurden die Zellen mit 4 % Formaldehyd fixiert und mit 0,5 % TritonX-100 solubilisiert. Es wurden primäre Antikörper für Western Blots (1:100-Verdünnung, 5 % BSA, 2 h, RT) und fluoreszenzmarkierte (Alexa Fluor 488 oder Alexa Fluor 555) sekundäre Antikörper (1:1000, 1 h RT, Abcam) verwendet. Nach der Montage mit ProLong™ Glass Antifade Mountant (ThermoFisher) wurden die Zellen mit einem konfokalen Nikon C2-Mikroskop in Verbindung mit der NIS Elements-Software abgebildet.

Für hochauflösende Studien wurden einige am Deckglas anhaftende Zellen 10 Minuten lang mit 100 nM Isoproterenol behandelt, bevor sie 5 Minuten lang in eiskaltem Methanol fixiert wurden. Nach dem Waschen wurden die Zellen in Blockierungspuffer blockiert (45 Minuten, RT): 20 % SEA Block (Thermo Fisher Scientific), 0,05 % v/v Triton X-100 in PBS. Die Zellen wurden über Nacht bei 4 °C mit monoklonalem Maus-Anti-CaV1.2 (UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Klon N263/31; 1:100) mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Caveolin-3 oder polyklonalem Kaninchen-β1-adrenergen Rezeptor-Antikörper inkubiert. Als Sekundärantikörper wurden Alexa Fluor 647-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG2b oder Alexa Fluor 555-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen (Life Technologies, 1:1000) verwendet.

Die Zellen wurden auf einem hochauflösenden Ground State Depletion (GSD)-Mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, mit freundlicher Genehmigung von Dr. F. Santana) im TIRF-Modus mit einer Eindringtiefe von 150 nm abgebildet, wie zuvor beschrieben34. Die Fluoreszenz wurde durch einen Hochleistungs-TIRF-Quadfilterwürfel (QGS HP-T) von Leica mit Emissionsbandpassfiltern nachgewiesen. Die gesammelten Bilder wurden mit der Software Leica Application Suite (LAS AF) in hochauflösende Lokalisierungskarten rekonstruiert. Die Clusterflächengröße wurde anhand binärer Masken der Lokalisierungskarten mit einer Pixelgröße von 10 nm in ImageJ/Fidschi gemessen, wie zuvor beschrieben35.

Myozyten wurden in Fluo-4-AM (5 μM, Life Technologies, 20 Minuten) inkubiert und dann im Stromklemmenmodus mit überschwelligen Reizen unter Verwendung eines Spannungsklemmenverstärkers Axopatch 200B (Molecular Devices) stimuliert. Das Signal wurde mit einer Zyla 5.5 sCMOS-Kamera und der Software MetaMorph 7.10.3 aufgezeichnet.

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angegeben. Die statistische Analyse wurde mit der Prism GraphPad-Software durchgeführt. Der Shapiro-Wilk-Normalitätstest wurde verwendet, um zu beurteilen, ob die Daten normalverteilt waren. Wenn die Daten normalverteilt waren, wurde eine Brown-Forsyth- und Welch-ANOVA verwendet, um die Unterschiede zwischen wt- und αMHC403/+-Gruppen zu analysieren. Wenn die Daten nicht normalverteilt waren, wurde eine Kruskal-Wallis-ANOVA durchgeführt. Zur Korrektur mehrerer Vergleiche wurde ein Dunn-Test verwendet. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Chemikalien und Reagenzien von Sigma-Merck bezogen.

Während der aktuellen Studie generierte und/oder analysierte Datensätze sind im Datenrepository der University of Western Australia https://research-repository.uwa.edu.au/en/datasets/ verfügbar. Weitere Datensätze, die von kooperierenden Autoren während der aktuellen Studie verwendet und/oder analysiert wurden, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

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Fakultät für Humanwissenschaften, University of Western Australia, Crawley, WA, Australien

Henrietta Cserne Szappanos, Helena M. Viola und Livia C. Hool

Abteilung für Physiologie und Membranbiologie, University of California, Davis, CA, USA

Danica W. Ito und Rose E. Dixon

Agnes Ginges Centre for Molecular Cardiology, Centenary Institute, Sydney, Australien

Seakcheng Lim, Mira Holliday, Samantha Barratt Ross und Christopher Semsarian

Sydney Medical School, Universität Sydney, Sydney, Australien

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Melissa Mangala, Adam Hill und Livia C. Hool

Abteilung für Kardiologie, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, Australien

Christopher Semsarian

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HCS führte alle In-vivo-Elektrokardiogramm- und Echokardiographie-Studien, Ex-vivo-Myozyten-Elektrophysiologie-Studien sowie alle Immunoblot-Analysen durch und verfasste den Artikel H.V. führte Kalziumtransienten durch und redigierte die Arbeit. D.WI und RED führten alle hochauflösenden Nanoskopiestudien durch. SL, MM, MH, SBR, AH und CS führten iPSC-Studien durch. L.H. entwarf und koordinierte die Studien, half bei der Analyse und verfasste die Arbeit. Alle Autoren haben die Einreichung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Livia C. Hool.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Cserne Szappanos, H., Viola, HM, Ito, DW et al. Eine Störung des Zytoskeletts erhöht die arrhythmogene Anfälligkeit während der sympathischen Stimulation in einem Modell der hypertrophen Kardiomyopathie. Sci Rep 13, 11296 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38296-2

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Eingegangen: 12. April 2023

Angenommen: 06. Juli 2023

Veröffentlicht: 12. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38296-2

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