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Jul 08, 2023

Der Verlust von Stacheln im prälimbischen Kortex wirkt sich nachteilig auf das Arbeitsgedächtnis bei Mäusen mit frühem Wachstum aus

Molekulare Psychiatrie (2023)Diesen Artikel zitieren 679 Zugriffe auf 6 altmetrische Metrikdetails Unerwünschte Erfahrungen im frühen Leben können neuronale Strukturen und synaptische Funktionen in mehreren Gehirnregionen beeinflussen.

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Ungünstige Erfahrungen im frühen Leben können neuronale Strukturen und synaptische Funktionen in mehreren Gehirnregionen beeinflussen und später im Leben zu Defiziten bestimmter kognitiver Funktionen führen. Mit Schwerpunkt auf den Pyramidenzellen des prälimbischen Kortex (PrL), einer Hauptunterregion des medialen präfrontalen Kortex, wurden die Auswirkungen von Widrigkeiten im frühen Leben (ELA) in einem etablierten Tiermodell untersucht, das durch Veränderung der Aufzuchtumgebung während der postnatalen Tage generiert wurde 2 bis 9 (P2-P9), eine sensible Entwicklungsphase. ELA hat nachhaltige schädliche Auswirkungen auf die dendritischen Stacheln von PrL-Pyramidenzellen, was am deutlichsten in einem räumlich umschriebenen Bereich auftritt. Insbesondere betrifft ELA sowohl dünne als auch pilzartige Stacheln, und ein durch ELA verursachter Verlust von Stacheln wird an selektiven dendritischen Segmenten von PrL-Pyramidenzellen in den Schichten II-III und V-VI beobachtet. Reduzierte postsynaptische Puncta, die durch das postsynaptische Dichteprotein 95 (PSD-95) dargestellt werden, jedoch nicht durch Synaptophysin-markierte präsynaptische Puncta, bei ELA-Mäusen unterstützen den selektiven Verlust von Stacheln im PrL. Die Korrelationsanalyse weist darauf hin, dass der Verlust von Stacheln und postsynaptischen Puncta im PrL zum schlechten räumlichen Arbeitsgedächtnis von ELA-Mäusen beiträgt und dünne Stacheln möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Leistung des Arbeitsgedächtnisses spielen. Um besser zu verstehen, ob der Verlust von Stacheln die glutamaterge Übertragung beeinflusst, wurden AMPA- und NMDA-Rezeptor-vermittelte synaptische Ströme (EPSCs) in einer Gruppe von Thy1-exprimierenden PrL-Pyramidenzellen aufgezeichnet. ELA-Mäuse zeigten eine verminderte glutamaterge Übertragung, die mit einer verminderten Expression der GluR1- und NR1-Untereinheiten im PrL einhergeht. Schließlich kann die Hochregulierung der Aktivierung von Thy1-exprimierenden PrL-Pyramidenzellen über exzitatorische DREADDs die Arbeitsgedächtnisleistung von ELA-Mäusen in einer T-Labyrinth-basierten Aufgabe effizient verbessern, was auf das Potenzial eines chemogenetischen Ansatzes zur Wiederherstellung ELA-bedingter Gedächtnisdefizite hinweist.

Widrigkeiten im frühen Leben (ELA) können enorme Auswirkungen auf die dendritische Struktur und die neuronale Aktivität haben und später im Leben zu kognitiven Defiziten führen [1,2,3,4,5]. Studien an Nagetieren haben gezeigt, dass ELA über eine veränderte Käfigumgebung während einer sensiblen Entwicklungsphase die deklarativen und erkennenden Gedächtnisfunktionen zunehmend stört, wenn die Tiere erwachsen werden [6,7,8,9]. Wichtig ist, dass die fortschreitenden Gedächtnisstörungen größtenteils auf der Verzögerung dendritischer Äste und synaptischer Kontakte in Gehirnregionen beruhen, die für Gedächtnisfunktionen zuständig sind. Während in einer Vielzahl von Studien über ELA-bedingte dendritische Atrophie und Wirbelsäulenverlust im Hippocampus berichtet wurde [z. B. 6,7,8], wurden Veränderungen an Dendriten auch im präfrontalen Kortex (PFC) von ELA-Mäusen gefunden [10]. Während der postnatalen Entwicklung trägt der Hippocampus wesentlich zur angemessenen Differenzierung und Erhaltung der Pyramidenzellen im PFC bei [11,12,13]. Studien haben außerdem den Beitrag von Hippocampus-Eingaben zur Reifung präfrontaler Funktionen identifiziert [11, 13] und die enge Verbindung zwischen Hippocampus und PFC hervorgehoben. Während die schädlichen Auswirkungen von ELA auf die synaptische Struktur und Gedächtnisfunktionen des Hippocampus umfassend untersucht wurden [z. B. 6, 9, 14, 15, 16], sind die möglichen Auswirkungen von ELA auf präfrontale Zellen und die präfrontalabhängige Funktion noch viel weniger untersucht.

Der PFC bei Nagetieren ist eine anatomisch und funktionell heterogene Gehirnstruktur, die aus prälimbischen (PrL), infralimbischen, medialen agranulären und anterioren cingulären Kortizes besteht [17, 18]. Der PrL ist einer der am besten untersuchten Unterbereiche des PFC und wurde mit einer Reihe kognitiver Prozesse wie dem Arbeitsgedächtnis in Verbindung gebracht [18,19,20]. Die Hauptzellen in dieser Subregion sind die Pyramidenzellen, die sich in den Schichten II–III und V–VI befinden und etwa 80–90 % der gesamten Zellpopulation ausmachen [21]. Studien haben gezeigt, dass sich die Pyramidenzellen in den Schichten II-III und V-VI hinsichtlich ihrer physiologischen Eigenschaften und afferenten Projektionen unterscheiden [11,12,13, 22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32]. Während beispielsweise die Pyramidenzellen in den Schichten II–III Projektionen von der basolateralen Amygdala erhalten [30], erhalten die Zellen in den Schichten V–VI monosynaptische glutamaterge Eingaben vom ventralen Hippocampus und dem mediodorsalen Thalamuskern [32]. Insbesondere sind die dendritischen Stacheln der PrL-Pyramidenzellen die Hauptziele der extrinsischen glutamatergen Eingaben [11,12,13] und es wird angenommen, dass sie die strukturelle Grundlage für das Arbeitsgedächtnis bilden [33,34,35]. Diese Stacheln sind für die Reifung der präfrontalen Aktivität und die Aufrechterhaltung der synaptischen Verbindungen zwischen Präfrontal und Hippocampus von wesentlicher Bedeutung. Veränderungen in der Anzahl, Größe und Form der Stacheln wurden mit veränderten synaptischen Kontakten und neuronaler Aktivität in Verbindung gebracht, die die normalen präfrontalen Funktionen beeinträchtigen können [33, 34, 36]. Tatsächlich haben Studien berichtet, dass die neuronale Aktivität in einem sich entwickelnden PFC maßgeblich von den Pyramidenzellen in den Schichten II–III gesteuert wird [37, 38], und Berichte haben den Verlust von Stacheln auf Pyramidenzellen mit einer abnormalen Zellaktivität und Netzwerkaktivität in den Pyramidenzellen in Verbindung gebracht frontaler Kortex [39, 40]. Eine abnormale synaptische Aktion und eine gestörte frontale Aktivität wurden bei einer Vielzahl von psychischen Störungen stark mit kognitiven und emotionalen Dysfunktionen in Verbindung gebracht [z. B. 39, 41, 42].

Durch ELA hervorgerufene lebenslange Veränderungen der kognitiven Funktion können durch die Unterbrechung der dendritischen Differenzierung und die Gestaltung synaptischer Kontakte hervorgerufen werden [8, 9, 43, 44, 45]. Studien haben gezeigt, dass präfrontale Pyramidenzellen im frühen postnatalen Leben bemerkenswerte Veränderungen in ihren funktionellen Eigenschaften und ihrer Morphologie erfahren. Diese Zellen sind äußerst anfällig für Stressreize [1, 46]. Hier konzentrierten wir uns auf die Pyramidenzellen im PrL und untersuchten die dauerhaften Einflüsse von ELA auf dendritische Stacheln und synaptische Ströme sowie die präfrontalabhängige Gedächtnisfunktion. Angesichts der geschlechtsabhängigen Auswirkungen von Stress wurden männliche Mäuse unter Verwendung eines etablierten ELA-Tiermodells [8, 10, 45, 47] eingesetzt, bei dem ELA über eine veränderte Käfigumgebung durch Reduzierung von Nist- und Einstreumaterialien während P2 erzeugt wurde –9. Ein durch ELA verursachter Verlust von Stacheln wurde an ausgewählten dendritischen Segmenten von PrL-Pyramidenzellen beobachtet. Reduzierte postsynaptische Puncta, die durch das postsynaptische Dichteprotein-95 (PSD-95) dargestellt werden, jedoch keine präsynaptischen Puncta bei ELA-Mäusen, unterstützen den selektiven Verlust von Stacheln im PrL. Wichtig ist, dass das räumliche Arbeitsgedächtnis mit der Dichte der Stacheln auf PrL-Pyramidenzellen und der Anzahl der PSD-95-Punkte in den PrL-Schichten II-III und V-VI korrelierte, was darauf hindeutet, dass die Integrität dendritischer Stacheln auf PrL-Pyramidenzellen für die frontale Arbeit von entscheidender Bedeutung ist Erinnerung. Um die funktionellen Folgen des durch ELA hervorgerufenen Wirbelsäulenverlusts besser zu verstehen, verglichen wir die erregenden postsynaptischen Ströme (EPSCs) einer Gruppe von Thy1-exprimierenden frontalen Pyramidenzellen in ELA-Mäusen und Kontrolltieren und stellten eine verminderte glutamaterge Übertragung und eine verminderte Expression des selektiven Glutamatrezeptors fest Untereinheiten in ELA-Mäusen. Interessanterweise kann die chemogenetische Aktivierung von Thy1-exprimierenden Pyramidenzellen im PrL über exzitatorische Designer-Rezeptoren, die ausschließlich durch entworfene Medikamente aktiviert werden (DREADDs), das räumliche Arbeitsgedächtnis bei ELA-Mäusen effizient verbessern.

Es wurden C57BL/6J-, B6.Cg-TgN(Thy1-YFPH)2Jrs- und FVB/N-Tg(Thy1-Cre)1Vln/J (Thy1-Cre)-Mäuse verwendet. C57-Mäuse wurden von Guangzhou Ruige BioTech Ltd (SCXK: 2021–0059) erhalten. Transgene Thy1-YFPH- und Thy1-Cre-Mäuse wurden von Jackson Labs (Best.-Nr. 003782 bzw. 006143) erhalten. Diese Mäuse wurden in Gruppen in Standardkäfigen mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Licht an um 7:00 Uhr morgens) gehalten und hatten nach Belieben Zugang zu Standardfutter und Wasser für Nagetiere. Trächtige Mäuse wurden in getrennten Käfigen gehalten und der Tag der Geburt wurde als postnataler Tag 0 (P0) aufgezeichnet. Die Welpen wurden auf P2 gesammelt und 6 Welpen wurden nach dem Zufallsprinzip jedem Muttertier zugeteilt, wie beschrieben [9, 45]. Es wurden drei Kohorten von C57-Mäusen eingesetzt: eine wurde einer Golgi-Färbung unterzogen, die zweite einer spontanen Wechselaufgabe, die mit synaptischen Markern korrelierte, und die dritte einer belohnten Wechselaufgabe. Es wurden zwei Kohorten von Thy1-YFPH-Mäusen verwendet: Eine Kohorte wurde einer T-Labyrinth-Aufgabe unterzogen, gefolgt von einer Wirbelsäulenanalyse, und die andere einer physiologischen Aufzeichnung und Analyse von Rezeptoren. Für DREADD-Experimente wurden zwei Kohorten von Thy1-Cre-Mäusen verwendet. Aufgrund der geschlechtsabhängigen Auswirkungen von Stress wurden nur männliche Mäuse analysiert. Alle Verfahren wurden gemäß dem National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Die Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Guangzhou Medical University genehmigt.

Das ELA-Tiermodell wurde wie zuvor beschrieben erstellt [9, 45, 47]. In P2 wurden Muttertiere und Jungtiere der ELA-Gruppe in Käfige mit begrenztem Nist- und Einstreumaterial überführt, und das ELA-Paradigma dauerte 7 Tage (P2–9). In den Käfigen der ELA-Gruppe wurde ein kunststoffbeschichtetes Aluminiumnetz (Durchmesser 0,2 cm) ca. 2,5 cm über dem Käfigboden installiert und ein halbes Stück Baumwollquadrat als Nistmaterial auf das Netz gelegt. Kontrolltiere und Jungtiere wurden in Käfigen mit normalem Nist- und Einstreumaterial untergebracht. Kontroll- und ELA-Käfige wurden per Video überwacht, blieben aber während P2-P9 ungestört [9, 45]. Am Ende der ELA-Bedingung wurden die Welpen und Muttertiere in normale Käfige zurückgebracht.

Junge erwachsene Mäuse (4 Monate alt) wurden mit einer verdünnten Euthasol-Lösung anästhesiert und über die Aorta mit 0,9 %iger Kochsalzlösung perfundiert [9, 45]. Die Gehirne wurden entweder für die Golgi-Färbung entnommen oder für Western Blot und Immunhistochemie in Hemisphären aufgeteilt. Thy1-YFPH-Mäuse wurden im frischen Zustand einem Gehirnschnitt unterzogen [48] oder 2 Minuten lang mit Kochsalzlösung perfundiert, gefolgt von 25 Minuten lang 4 % Paraformaldehyd (PFA, in 0,1 M PB, pH 7,4). Die perfundierten Gehirne von YFPH-Mäusen wurden 4–6 Stunden lang (4 °C) in 4 % PFA nachfixiert, in 30 % Saccharose in 0,1 M PB (4 °C) kryogeschützt und dann für die Immunhistochemie koronal geschnitten (20 µm) [49] . Entsprechende Schnitte aus dem präfrontalen Kortex (AP 2,58–1,54 mm) von zwei Gruppen wurden auf einem Objektträger montiert und jeder sechste Schnitt wurde gesammelt. Nissl-Färbeschnitte wurden verwendet, um die Zytoarchitekturen und Grenzen des PrL zu identifizieren.

Der Test wurde wie beschrieben in einem T-Labyrinth durchgeführt [50, 51]. Das Labyrinth besteht aus drei gleich großen Armen (35 × 7 cm, 15 cm hoch) und einer zentralen Zone (7 × 7 cm), die mit rotem Licht beleuchtet wird. Vor dem Test wurden die Mäuse eine Woche lang 2 Minuten pro Tag behandelt, um den Experimentator und den Handhabungsprozess zu gewöhnen. Am Testtag wurden die Mäuse 30 Minuten lang an den Testraum gewöhnt, gefolgt von einem Probenversuch (T0). Kurz gesagt, eine Maus wurde am distalen Ende des Startarms platziert, wobei ihr Kopf zur Endwand des Labyrinths ausgerichtet war. Wenn die Maus vollständig in einen Zielarm eingedrungen war (Schwanzspitzenkriterium), wurde die Tür dahinter geschlossen und die Maus wurde 30 Sekunden lang im Arm gehalten. Nach dem T0-Versuch wurde die Maus vorsichtig entfernt und für 6 Testversuche (T1–T6) mit einem Intervall von 5 s zwischen den Versuchen wieder auf den Startarm gesetzt. Die Cut-Off-Zeit für jeden Versuch betrug 90 Sekunden und der Test wurde am folgenden Tag wiederholt. Ein Overhead-Kamerasystem (EthoVision, Noldus) wurde verwendet, um die Besuche jedes Torarms, die Zeit, die sie mit Ruhe und Aktivität verbrachten, und die insgesamt zurückgelegte Distanz zu verfolgen. Für jede Maus wurde der Besuch eines anderen Torarms als in einem früheren Versuch als korrekte Abwechslung gewertet, während die Wahl desselben Torarms als Fehler gewertet wurde. Der Prozentsatz korrekter Wechsel über alle Versuche wurde als Index des Arbeitsgedächtnisses berechnet, d. h. (Gesamtzahl korrekter Wechsel/6) × 100. Die Wahllatenz (Sek.) war die Zeit, die für das Betreten des Zielarms aufgewendet wurde. Das Labyrinth wurde vor der Verwendung durch die nächste Maus mit einem mit 30 % Ethanol getränkten Papiertuch gereinigt.

Es wurde das oben beschriebene T-Labyrinth verwendet. Am Ende jedes Torarms (2 cm vom Rand entfernt) wurde ein Futterbrunnen (1 cm Durchmesser und 0,5 cm Tiefe) angebracht. Die Mäuse wurden während des Experiments leicht ernährungsbeschränkt und auf etwa 90 % ihres Körpergewichts bei freier Nahrungsaufnahme gehalten. Nach 3 Tagen Handhabung (2 Minuten pro Tag) wurden die Mäuse an das Labyrinth gewöhnt und erhielten 4 Tage lang Futter als Belohnung. Während des Gewöhnungsprozesses wurden alle Arme geöffnet und saccharosehaltige Pellets (10 mg × 10) in die Nahrungsvertiefung jedes Zielarms gegeben. Die Mäuse wurden in den Startarm gesetzt und hatten 5 Minuten freie Erkundung, um die verfügbaren Pellets zu verbrauchen. Mäuse, die die Pellets am letzten Tag nicht innerhalb von 5 Minuten konsumierten, wurden ausgeschlossen. Der Test umfasste einen Probenversuch und 12 Testversuche und wurde am folgenden Tag wiederholt. Im Musterversuch wurden beide Torarme mit je 5 Pellets beködert. Als eine Maus in einen Arm eindrang, wurde die Tür zum anderen geschlossen. Während der Testversuche (5-s-Intervall) wurden Pellets nur in den Arm gelegt, der in einem früheren Versuch nicht besucht wurde, um einem Win-Shift-Kriterium zu folgen [52]. Jeder Versuch wurde beendet, indem die Tür geschlossen wurde, nachdem die Maus die Pellets gefressen hatte und zum Startarm zurückkehrte oder sich in der zentralen Zone ausruhte. Die Anzahl der korrekten Eingaben in beköderte Waffen wurde erfasst. Als Index für das Arbeitsgedächtnis diente der Prozentsatz der richtigen Entscheidungen über alle Testdurchgänge. Die Latenzzeit bis zum Aufnehmen der Pellets und die Zeit bis zum Abschluss (von dem Moment, in dem eine Maus den Startarm betrat, bis zu dem Moment, in dem sie in den Arm zurückkehrte) wurden gemessen. Das Labyrinth wurde wie oben beschrieben mit 30 % Ethanol gereinigt.

Die Mäuse wurden eine Woche lang täglich (2 Minuten pro Tag) behandelt, um sich an die Testbedingungen zu gewöhnen und die Stresseffekte während der Experimente zu reduzieren. Die Tests wurden in einer weißen Plexiglas-Freifeldarena (45 × 45 cm, mit 35 cm hohen Wänden) durchgeführt, die mit rotem Licht beleuchtet wurde. Die Maus wurde in einer Ecke der Arena platziert und konnte 10 Minuten lang frei erkundet werden. Die Bewegung wurde von einer Overhead-Kamera überwacht und über die ANY-maze-Software (v7, Stoelting Co.) verfolgt. Zur Datenanalyse wurde der Geräteboden in 16 gleiche Quadrate (4 innere und 12 äußere) unterteilt. Der Prozentsatz der im Zentrum, den 4 inneren Quadraten, verbrachten Zeit der insgesamt 16 Quadrate wurde berechnet [53]. Zwischen den einzelnen Tieren wurde die Arena mit 30 %igem Ethanol gereinigt.

Die Mäuse wurden zur Akklimatisierung 30 Minuten lang in einen Testraum transportiert. Ein Paar Käfigkameraden wurde getrennt in zwei mit Wasser gefüllte Polycarbonatzylinder (20 cm Durchmesser, 40 cm Höhe) (25 cm Tiefe, 25 °C) platziert. Mäuse konnten den Boden der Zylinder nicht berühren. Der Test dauerte 6 Minuten und wurde von einem Experimentator überwacht, der keine Ahnung von der Identität der Mäuse hatte. Das Verhalten der Tiere wurde mit einem Overhead-Kamerasystem (EthoVision, Noldus) verfolgt. Die Dauer der Immobilität (Schwimmen) und des Schwimmens wurde gemessen und die Daten der letzten 4 Minuten zur Analyse herangezogen. Am Ende des Tests wurden die Mäuse mit einem Handtuch getrocknet und für ca. 5 Minuten in einen vorgewärmten Käfig gesetzt und dann in ihre Heimkäfige zurückgebracht. Das Wasser in den Zylindern wurde zwischen einzelnen Mäusen ausgetauscht.

Der Serumcorticosteronspiegel (CORT) wurde durch Immunoassay unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (Shanghai Enzyme-linked Biotech) bestimmt [9]. Den Mäusen, die einer Golgi-Färbung unterzogen wurden, wurden Blutproben entnommen. Vor der Perfusion der Kochsalzlösung wurde Blut aus dem rechten Vorhof gesammelt (08:30–10:30 Uhr) und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur geronnen. Die Proben wurden 20 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde gesammelt und die Proteinkonzentration gemäß den Anweisungen gemessen. Das Probenverdünnungsmittel wurde bei 37 °C (1 Stunde) inkubiert. Die Reaktion wurde bei 37 °C im Dunkeln (15 Minuten) entwickelt und der OD-Wert bei 450 nm abgelesen.

Mäuse wurden über die Aorta mit Kochsalzlösung perfundiert, um Blut auszuspülen [9, 54]. Die Gehirne wurden aus dem Schädel entnommen und in einer Imprägnierungslösung zur Golgi-Färbung (eliteGolgi Kit, Bioenno Tech, CA) gesammelt. Die Lösung wurde nach einem Tag Imprägnierung im Dunkeln (22 ± 1 °C) erneuert. Die Imprägnierung dauerte insgesamt 5 Tage. Die Gewebeblöcke wurden koronal bei 200 µm geschnitten (Leica VT1200) und in 0,1 M PB (pH 7,4) gesammelt, gefolgt von einer parallelen Free-Floating-Färbung (5 Min.) und Klarheit (2 Min.) unter Verwendung des Kits. Für jedes Gehirn wurden Abschnitte aus dem PFC (4–5 Abschnitte pro Gehirn, Bregma 2,58–1,54 mm) auf mit Gelatine beschichtete Objektträger montiert. Die Schnitte wurden in Ethanol dehydriert, in Xylol geklärt und mit Permount®-Eindeckmedium bedeckt. Die Pyramidenzellen im PrL wurden durch Vergleiche mit Nissl-gefärbten Schnitten identifiziert.

Der präfrontale Kortex wurde präpariert und die PrL-Subregion weiter isoliert. Das präparierte Gewebe wurde in T-PER (ThermoFisher) (150 mg/ml) homogenisiert, das einen Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (1:100, Sigma-Aldrich) enthielt [54]. Die Probe wurde 1 Stunde lang bei 100.000 × g zentrifugiert und das Pellet mit 70 % Ameisensäure resuspendiert, gefolgt von einer weiteren Stunde Zentrifugation bei 100.000 × g. Proteinproben (20 µg) wurden auf 4–12 % Bis-Tris-Gel (Invitrogen) aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch behandelt, gefolgt von einer Inkubation in den Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C. Zu den Antikörpern gehörten Maus-Anti-PSD95 (1:5.000, Klon 7E3-1B8, Affinity BioReagents), Maus-Anti-Synaptophysin (1:10.000, Sigma), Kaninchen-Anti-GluR1 (1:2.000, Chemicon) und Maus-Anti-GluR2 ( 1:2.000, Klon 6C4, ThermoFisher), Maus-Anti-NR1 (1:2.000, Klon 54.1, ThermoFisher), Kaninchen-Anti-NR2A (1:4.000, A-6473, ThermoFisher), Kaninchen-Anti-NR2B (1:2.000, A-6474, ThermoFisher) und Maus-Anti-β-Actin (1:10.000, AC-15, abcam). Nach einem Waschen in TBS-T (3 × 5 Minuten) wurden die Membranen 1 Stunde lang in HRP-konjugiertem Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IgG (1:10.000; Pierce Biotech) inkubiert (RT) und mit SuperSignal (ThermoFisher) entwickelt ). Die Signalspezifität wurde getestet [54]. Die optischen Dichten der Proteinbanden wurden mit ImageJ (v2) erfasst. Die Dichten der Banden, die synaptischen Markern und Rezeptoren entsprechen, wurden auf die jeweiligen Aktinspiegel normalisiert und als Prozentsatz der Kontrollgruppenwerte ausgedrückt.

Perfundierte Gehirne wurden mit einem Kryostat bei 20 μm geschnitten und 1 von 6 Serienschnitten wurden gesammelt und IHC und FI unterzogen (45, 49). Für die Einzelmarkierung von IHC wurden frei schwebende Schnitte 1 Stunde lang mit 5 % normalem Serum blockiert, gefolgt von einer Inkubation in Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C. Die Antikörper umfassten Kaninchen-Anti-Fos (1:40.000, Oncogene, Ab-5) und Anti-RFP-Biotin-konjugiert (1:500, Rockland, Kat.-Nr. 600-906-379 S). Die Schnitte wurden in biotinyliertem Anti-Kaninchen-IgG (1:200, 2 Stunden, Vektor) und anschließend in Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexlösung (1:100, 3 Stunden, Vektor) inkubiert oder direkt in der Komplexlösung 3 Stunden lang inkubiert . Das Reaktionsprodukt wurde in 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) mit 0,01 % H2O2 (Bioenno Tech) entwickelt. Zur doppelten Markierung von mCherry und Fos wurden die Schnitte zunächst mit anti-RFP-Biotin-konjugiertem inkubiert, was ein braunes DAB-Reaktionsprodukt ergab. Anschließend wurden die Schnitte in Fos-Antikörper (1:20.000) inkubiert und in DAB-Kobaltlösung mit H2O2 (Bioenno Tech) entwickelt. FI wurde an frei schwebenden Abschnitten durchgeführt [45]. Die Schnitte wurden mit Anti-PSD-95 (1:2.000, Klon 7E3-1B8; 2 Tage) oder Anti-Synaptophysin (1:10.000, Sigma; über Nacht) bei 4 °C inkubiert. Die Antikörperbindung wurde mit Anti-Maus-IgG sichtbar gemacht, das an Alexa Fluor 568 (1:200, Molecular Probes) konjugiert war. Über die Spezifität der Immunreaktion wurde bereits berichtet [49, 55]. Kurz gesagt, der primäre Antikörper wurde über Nacht bei 4 °C mit einem gereinigten rekombinanten Protein PSD-95 (5 µg/ml, Novus Biologicals, CO, USA) oder Synaptophysin (2 µg/ml, Novus Biologicals) voradsorbiert, was zu einem Ergebnis führte in Abwesenheit markierter synaptischer Puncta in den Abschnitten (nicht gezeigt). Darüber hinaus wurde keine Färbung auf den Schnitten beobachtet, wenn der primäre Antikörper (nicht gezeigt) durch normales Maus-IgG (1:2.000, Vektor) ersetzt wurde.

Zur Bewertung dendritischer Dornen im PrL wurden zwei Ansätze angewendet. (1) Die Anzahl der Wirbelsäulen in Golgi-gefärbten Schnitten wurde anhand rekonstruierter Pyramidenzellen berechnet [9, 54]. Kurz gesagt, Golgi-gefärbte Serienschnitte wurden mit einem Hellfeldmikroskop (Nikon E400) gründlich untersucht und mit Nissl-gefärbten Schnitten verglichen, um die Schichten des PrL (Bregma 2,58–1,54 mm) zu identifizieren. In den Schichten II-III und V-VI wurden die Pyramidenzellen mit gut imprägnierten apikalen und basalen Dendriten ausgewählt (3–4 Zellen/Region/Gehirn und insgesamt 30–32 Zellen/Gruppe) und unter einer 100-fachen Vergrößerung eingefangen. 1,4 Öllinse. Bilder der Z-Serie (2-µm-Schritte) wurden mit einem Nikon DS-Fi3-Kamerasystem aufgenommen und mit Imaris (v7.1.0) und Adobe Photoshop (v6) rekonstruiert. Mithilfe von Bildern mit hoher Vergrößerung und Z-Stapelung konnten alle Dornen eines bestimmten dendritischen Segments identifiziert und gezählt werden. Angesichts der Tatsache, dass die Wirbelsäulendichte über verschiedene Dendritenordnungen hinweg variiert, wurde die Wirbelsäulendichte mithilfe konzentrischer Kreise in einem Abstand von 20 µm analysiert. Die Daten von apikalen und basalen Dendriten wurden nach Zelle und dann nach Tier gruppiert. (2) Die Wirbelsäulen in YFPH-Gehirnschnitten wurden mit Hilfe von Stereo Investigator (MBF Bioscience) unter Verwendung der stereologischen Fraktionatormethode gezählt. Eine Reihe von Abschnitten (1 von 6) aus der PrL wurde einer Zählung unterzogen [54]. Die Schichten II-III und V-VI im PrL wurden mit einem 5-fach-Objektiv definiert und die Stacheln wurden mit einem 100/1,4-Objektiv gezählt. Stacheln wurden in pilzartige Stacheln (mit einem Kopfdurchmesser von mehr als 0,6 µm) und dünne Stacheln (mit einem Kopfdurchmesser von weniger als 0,6 µm und einer maximalen Länge, die mindestens dem Doppelten des Kopfdurchmessers entspricht) eingeteilt [49, 56, 57]. . Stummelstacheln und Filopodien wurden nicht häufig beobachtet und nicht gezählt. Die Stacheldichte wurde als Anzahl der Stacheln pro 20 µm des dendritischen Segments ausgedrückt.

PSD-95-ir- und Syn-ir-Synapsenpunkte wurden im PrL stereologisch gezählt [9, 49, 57]. Es wurden 7–8 Schnitte pro Tier verwendet und Z-Stapelbilder wurden mit einem konfokalen Zeiss 510-Mikroskop bei 63×/1,4 aufgenommen. Die interessierenden Bereiche wurden zunächst mit einem 10-fach-Objektiv definiert. Die Bilder wurden von den PrL-Schichten II-III und V-VI aufgenommen. Es wurden ein Probenahmegitter von 200 × 200 µm, ein Zählrahmen von 25 × 25 µm und eine Schutzzone von 10 µm verwendet. Dreidimensionale Bildstapel wurden für die iterative Entfaltung mit einer Konfidenz von 99 % (Volocity 6,3) verarbeitet. Pixelwerte (8 Bit) wurden mithilfe einer Intensitätsschwellenreihe mit festen Intervallen (4 %-Intervalle von 15–75 % des Maximums) iterativ binarisiert, gefolgt von Erosions- und Dilatationsfilterung, was eine zuverlässige Erkennung der Grenzen sowohl schwach als auch stark markierter Puncta ermöglichte . Schnitte aus zwei Gruppen wurden gleichzeitig verarbeitet und analysiert, ohne dass die Behandlungsgruppe bekannt war.

Systematische Schnittserien (jedes Sechste) im gesamten PrL von Mäusen mit oder ohne CNO-Verabreichung wurden ohne Kenntnis der Behandlung untersucht. Die Dichte der Fos-exprimierenden Zellen wurde mit einem quadratischen Gittersystem [55] mit Hilfe von ImageJ (v2) über den gesamten untersuchten Bereich unter Verwendung eines Nikon E400-Mikroskops bei 400-facher Vergrößerung ermittelt. Es wurden sechs Schnitte pro Maus verwendet. Zellen in einer Fläche von 600 × 600 μm2 wurden auf der Grundlage unvoreingenommener stereologischer Prinzipien gezählt. Fos-exprimierende Zellen wurden nur dann in die Zählung einbezogen, wenn mehr als die Hälfte des Zellkerns markiert war, und die Dichte wurde als Anzahl der markierten Zellen in einer realen Fläche von 36 × 104 μm2 ausgedrückt.

Von Thy1-EYFP-Mäusen wurden Gehirnschnitte hergestellt, die PrL enthielten. Kurz gesagt, Mausgehirne wurden schnell entnommen und in eiskaltes und sauerstoffhaltiges ACSF gelegt [48]. Koronale Schnitte (300 µm) wurden 1 Stunde lang in sauerstoffhaltigem ACSF gewonnen und dann in eine Aufbewahrungskammer mit sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung (20–22 °C) überführt [48]. Frontalpyramidenzellen in den Schichten II-III und V-VI wurden mit einem aufrechten Mikroskop mit Epifluoreszenzoptik (Nikon, Eclipse FN1) sichtbar gemacht. In den AMPAR-EPSC-Aufzeichnungen wurden Bicucullin (10 µM) und D-APV (20 µM) hinzugefügt, um die GABAAR- und NMDAR-Aktivierung zu blockieren. Bicucullin (10 µM) und CNQX (20 µM) wurden in den NMDAR-EPSC-Aufzeichnungen hinzugefügt. Die Patch-Elektroden waren gefüllt mit (in mM, ~270 mOsm): 130 Cäsiummethansulfonat, 10 CsCl, 4 NaCl, 10 HEPES, 1 MgCl2, 5 EGTA, 2,2 QX-314, 12 Tris-Phosphokreatin, 5 MgATP, 0,2 Na3GTP, und 0,1 Leupeptin. Um die Eingabe-Ausgabe-Reaktionen zu bestimmen, wurde EPSC durch eine Reihe von Stimulationen mit Intensitäten von 5, 7 und 9 V mit derselben Impulsdauer (0,06 bzw. 0,6 ms für AMPAR- bzw. NMDAR-EPSC) hervorgerufen Die bipolare Stimulationselektrode (FHC, Bowdoin) wurde 50–100 µm von der Unteraufzeichnung der Pyramidenzelle entfernt platziert. Für die AMPAR-EPSC-Aufzeichnung wurde das Membranpotential bei –70 mV gehalten. Um NMDAR-EPSC aufzuzeichnen, wurden die geklemmten Zellen (bei –70 mV) 3 s lang auf +60 mV depolarisiert. Um Miniatur-EPSC (mEPSC) aufzuzeichnen, wurde die extrazelluläre Lösung so modifiziert, dass sie 1 mM MgCl2 enthielt. Alle Aufnahmen wurden mit einem Axopatch 1D-Verstärker (Molecular Devices) und pClamp 9 durchgeführt. Am Ende der Aufnahmen wurden Schnitte für das Western Blot gesammelt.

Mäuse wurden mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (100 bzw. 10 mg/kg Körpergewicht, ip) anästhesiert. pAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry (Addgene, #44361-AAV2) wurde bilateral über eine gezogene Glaspipette (Spitzendurchmesser ~20 μm) und einen Parker's Picospritzer III (Pine Brook) in das PrL abgegeben. Ein computergesteuerter dreiachsiger Mikromanipulator (Stoelting Co.) wurde verwendet, um die Koordinaten (AP: 1,69 mm, ML: 0 mm bei ±6° schräg, DV: 2,50 mm) der Injektionsstellen zu bestimmen. Die Injektion erfolgte 5 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 40 nL/min und die Pipette wurde 10 Minuten lang an Ort und Stelle gehalten, um einen Virusrückfluss nach der Injektion zu verhindern. Die Mäuse wurden 4 Wochen lang am Leben gehalten und einer Verabreichung von 1 mg/kg CNO (HelloBio #HB6149) oder Kochsalzlösung unterzogen, gefolgt von einem Gedächtnistest. Mäuse wurden 90 Minuten nach der CNO-Verabreichung mit 4 % PFA perfundiert. Hirngewebe wurde koronal geschnitten (20 µm), um die Orte der Virusinjektion und auf Fos IHC zu überprüfen [55]. Das Kontrollvirus AAV2-DIO-mCherry diente als experimentelle Kontrolle für mögliche Off-Target-Effekte von CNO.

Die Daten wurden mit Prism 9 (GraphPad) und SPSS 22.0 (SPSS Inc.) analysiert. Eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen (Zwei-Wege-RM-ANOVA) mit Tag/Versuch/Behandlung/Segment als wiederholtem Faktor wurde verwendet, um die Auswahllatenz bei Gedächtnisaufgaben, die Fos-Expression als Reaktion auf CNO/Vehikelbehandlungen und die Wirbelsäulendichte zu vergleichen auf verschiedenen dendritischen Segmenten, gefolgt von einem Post-hoc-Test nach Sidak oder Bonferroni. Um Unterschiede bei synaptischen Proteinen, synaptischen Puncta, Rezeptor-Untereinheiten und Wirbelsäulentypen zu erkennen, wurde eine gewöhnliche Zwei-Wege-ANOVA mit Gruppe und Schicht/Typ/Größe/Untereinheit als Faktoren eingesetzt, gefolgt von einem Post-hoc-Test nach Sidak oder Bonferroni. Der Student-t-Test wurde verwendet, um die Unterschiede in CORT, spontanem/belohntem Wechsel und durchschnittlicher Wirbelsäulendichte zwischen Kontroll- und ELA-Mäusen zu analysieren. Der gepaarte t-Test wurde verwendet, um die Wirkung von CNO mit der des Vehikels bei ELA-Mäusen zu vergleichen. Für die Korrelationsanalyse wurde der Pearson-Test verwendet. Es wurde eine einfache lineare Regression durchgeführt, die die 95 %-Konfidenzbänder in Diagrammen zeigt. Die Stichprobengröße für Verhaltenstests wurde durch eine Berechnung mit einer Trennschärfe von 80 % geschätzt. Der Kolmogorov-Smirnov-Test wurde verwendet, um die Normalität von Datensätzen zu testen. Die Signifikanz wurde auf eine Konfidenz von 95 % festgelegt. Zur Darstellung der Datenverteilung wurde in den Abbildungen ein Box-and-Whisker-Diagramm verwendet, wobei die Box den Median sowie das 25. und 75. Quartil darstellt.

Wir haben berichtet, dass ELA durch eine veränderte Käfigumgebung die mütterliche Betreuung störte, was zu chronischem Stress bei den Welpen führte [9, 45]. Als ELA-Mäuse zu jungen Erwachsenen (4 Monate alt) heranwuchsen, hatten sie ein vergleichbares Niveau an Basalplasma-CORT im Vergleich zu altersentsprechenden Kontrollen (115,5 ± 3,60 vs. 107,5 ± 2,80; t22 = 1,74, P = 0,10). Um die Auswirkungen von ELA auf dendritische Stacheln festzustellen, wurden die Mäuse einer Golgi-Färbung unterzogen, um die Pyramidenzellen im PrL zu markieren (Abb. 1A, B). Die Zellen in den Schichten II-III und V-VI sind in Abb. 1 bzw. Abb. 2 dargestellt. Auf basalen Dendriten wurden Stacheln seltener beobachtet (Abb. 1C, D; Abb. 2C, D). Stacheln auf apikalen Dendriten von PrL-Pyramidenzellen waren in den proximalen Segmenten spärlich und wurden innerhalb von 140–320 µm vom Soma deutlicher sichtbar (Abb. 1E, F; Abb. 2A, B). Daher wurden die Stacheln auf basalen und apikalen Dendriten mithilfe konzentrischer Kreise (20 µm, 40 µm, 60 µm usw.) getrennt gezählt [49].

A, B Golgi-gefärbte Zellen im PrL. Das repräsentative Bild (B) wurde von einer Kontrollmaus aufgenommen. Die eingerahmten Bereiche in B wurden in C und E vergrößert, um die basalen und apikalen Dendriten einer Pyramidenzelle in den Schichten II–III darzustellen. IL: infralimbisch; fmi: kleine Pinzette des Corpus callosum; ac: vordere Kommissur. C, D Basale Dendriten von Pyramidenzellen in den Schichten II-III einer Kontroll- und einer ELA-Maus. Die eingerahmten Segmente wurden in den rechten Feldern vergrößert, um dünne (Pfeile) und pilzartige (Pfeilspitzen) Stacheln zu zeigen. E, F Apikale Dendriten von PrL-Pyramidenzellen in einer Kontroll- und einer ELA-Maus. Die eingerahmten Segmente wurden in Einschüben vergrößert, um zahlreiche dünne (Pfeile) und pilzartige (Pfeilspitzen) Stacheln bei der Kontrollmaus und den Verlust von Stacheln bei der ELA-Maus anzuzeigen. G–K Quantitative Analyse. Eine verringerte Wirbelsäulendichte war bei ELA-Mäusen (n = 9) im Vergleich zu Kontrollen (n = 8) erkennbar (**P < 0,01). Der Anteil dünner und pilzartiger Stacheln war nicht betroffen (H). Der durch ELA verursachte Verlust von Stacheln (I), einschließlich dünner (J) und pilzartiger (K), Stacheln wurde hauptsächlich an apikalen Dendriten beobachtet, die 200–280 µm vom Soma der Pyramidenzellen entfernt waren (*P < 0,05, **P < 0,01). Bei den Basaldendriten wurde kein Unterschied beobachtet. Maßstabsbalken = 60 µm (B), 15 µm (linke Felder in C, D und E, F) und 6 µm (rechte Felder in C, D und Einsätze in E, F).

A, B Repräsentative apikale Dendriten von Pyramidenzellen in den Schichten V-VI in einer Kontroll- und einer ELA-Maus. Die eingerahmten Segmente wurden in den unteren Feldern vergrößert, um dünne (Pfeile) und pilzartige (Pfeilspitzen) Stacheln zu zeigen. C, D Basale Dendriten der Pyramidenzellen der Schichten V-VI in einer Kontrollmaus (A) und einer ELA-Maus (B). Die eingerahmten Segmente wurden in den rechten Feldern vergrößert, um dünne (Pfeile) und pilzartige (Pfeilspitzen) Stacheln anzuzeigen. E–I Eine Änderung der durchschnittlichen Dichte, jedoch nicht der Art der Stacheln, wurde bei ELA-Mäusen (n = 9) im Vergleich zu Kontrollen (n = 8) beobachtet (**P < 0,01). Die zweistufige RM-ANOVA ergab einen ELA-bedingten Verlust von Stacheln (F1,15 = 5,09, P = 0,0393) und einen segmentabhängigen Unterschied (F14,210 = 90,46, P < 0,0001). Bei den ELA-Mäusen war der Verlust von Stacheln (G), einschließlich dünner (H) und pilzartiger (I), Stacheln an apikalen Dendriten erkennbar, die 160–240 µm vom Soma der Pyramidenzellen entfernt waren (Post-hoc-Test, *P < 0,05, **P < 0,01). Bei den Basaldendriten wurde kein Unterschied beobachtet (P > 0,05). Maßstabsbalken = 25 µm (geringe Vergrößerung in A–D), 6 µm (untere Felder in A, B und rechte Felder in C, D).

Die durchschnittliche Wirbelsäulendichte der PrL-Pyramidenzellen in den Schichten II–III war bei ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen verringert (3,22 ± 0,07 gegenüber 3,67 ± 0,09; t15 = 4,14, **P < 0,01) (Abb. 1G). Der Prozentsatz dünner und pilzartiger Stacheln war zwischen den beiden Gruppen vergleichbar (zweistufige RM-ANOVA; Haupteffekt von ELA: F1,15 = 0,0001, P > 0,99) (Abb. 1H). ELA-assoziierter Wirbelsäulenverlust (F1,15 = 25,37, P = 0,0001) und segmentabhängige Unterschiede in der Wirbelsäulendichte (F11,165 = 301,9, P < 0,0001) waren signifikant. Der Post-hoc-Test zeigte, dass der Verlust der Stacheln bei den ELA-Mäusen auf eine geringere Dichte der Stacheln auf apikalen dendritischen Segmenten in 200–280 µm Entfernung vom Soma zurückzuführen war (*P < 0,05, **P < 0,01) und sowohl dünne als auch pilzartige Typstacheln waren betroffen (Abb. 1I–K). Auf basalen Dendriten waren die Stacheln nicht von ELA betroffen (P > 0,05) (Abb. 1I – K).

Rekonstruierte apikale und basale Dendriten von PrL-Pyramidenzellen in den Schichten V-VI (Abb. 2) wurden ebenfalls analysiert. Die durchschnittliche Wirbelsäulendichte war bei ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen niedriger (3,18 ± 0,09 vs. 3,80 ± 0,19; t15 = 3,12, **P < 0,01) (Abb. 2E). Der Anteil dünner und pilzartiger Stacheln war bei ELA-Mäusen und Kontrollen ähnlich (F1,15 = 0,0002, P = 0,98) (Abb. 2F). Bei apikalen Dendriten trat der Verlust der Wirbelsäule bei ELA-Mäusen auf Segmenten auf, die 160–240 µm vom Soma entfernt waren (Haupteffekt von ELA: F1,15 = 5,09, P = 0,0393; ELA×Segment-Wechselwirkung: F14,210 = 5,24, P < 0,0001). ), die sowohl dünne als auch pilzartige Stacheln betreffen (Post-hoc-Test, *P < 0,05, **P < 0,01) (Abb. 2G–I). Stacheln auf basalen Dendriten wurden von ELA nicht beeinflusst (P > 0,05) (Abb. 2G – I). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass ELA selektiv Stacheln auf apikalen Dendriten von Pyramidenzellen in den Schichten II-III und V-VI beeinflusst, was zum Verlust sowohl dünner als auch pilzartiger Stacheln in der PrL führt.

Angesichts des enormen Verlusts an Stacheln im PrL von ELA-Mäusen untersuchten wir, ob das frontalabhängige Arbeitsgedächtnis bei jungen erwachsenen Mäusen, die unter frühem Stress litten, verändert war (Abb. 3). Das räumliche Arbeitsgedächtnis wurde in einer Kohorte von Thy1-YFPH-Mäusen mithilfe einer T-Labyrinth-basierten spontanen Wechselaufgabe getestet, die nachweislich empfindlich auf frontale Dysfunktionen reagiert [50, 51]. Während Kontrollmäuse es vorzogen, einen neuen Arm zu erkunden, anstatt zu einem zuvor besuchten Arm zurückzukehren, was einen spontanen Wechsel von 72,69 % ± 5,54 (n = 12) zeigte, zeigten ELA-Mäuse eine Rate von 53,94 % ± 5,61 (n = 12). war niedriger als die Kontrollrate (t22 = 8,24, **P < 0,01) (Abb. 3A). Die Wahllatenz sowohl der Kontroll- als auch der ELA-Mäuse stieg im Laufe der Testsitzung (zweistufige RM-ANOVA mit Versuch als wiederholtem Faktor) mit einem Gruppenunterschied allmählich an (Haupteffekt von ELA: F1,22 = 21,82, P = 0,0001). Die ELA-Mäuse zeigten eine erhöhte Latenz bei T5 und T6 (Post-hoc-Test, *P = 0,029, **P < 0,01) (Abb. 3B). Die Zeit bis zum Abschluss der Auswahl wurde ebenfalls aufgezeichnet und es wurde kein Unterschied zwischen Kontroll- und ELA-Mäusen festgestellt (233,3 ± 9,64 vs. 239,4 ± 8,07 s; t22 = 1,67, P = 0,11), was darauf hindeutet, dass der verschobene Wechsel nicht mit dem Bewegungsapparat oder der Erkundung zusammenhängt Aktivität. Darüber hinaus wurden ELA-bedingte Arbeitsgedächtnisdefizite in einer Kohorte von C57-Mäusen über eine T-Labyrinth-basierte Win-Shift-Aufgabe verifiziert, bei der der belohnte Wechsel der ELA-Mäuse geringer war als der der Kontrollen (t22 = 5,00, n = 12, **P < 0,01) (Abb. 3C). In Übereinstimmung mit einem aktuellen Bericht [53] deuten Daten aus Stresstests im Freifeld (Abb. 3D) und beim erzwungenen Schwimmen (Abb. 3E) darauf hin, dass keine Auswirkungen von ELA auf Motivation und Stressreaktion erkennbar waren (Freifeld: t22 = 0,43). , P = 0,67; Schwimmen: t22 = 0,16, P = 0,87).

A–E Defektes Arbeitsgedächtnis bei ELA-Mäusen. Der spontane Wechsel (%) bei einer T-Labyrinth-Aufgabe war in einer Kohorte von Thy1-YFPH-ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen reduziert (t22 = 8,24, **P < 0,01) (A). Die Entscheidungslatenz dieser Mäuse zeigte in beiden Gruppen über die Versuche hinweg einen erhöhten Trend. ELA-Mäuse verbrachten während der letzten beiden Versuche (T5 und T6) längere Zeit damit, einen Zielarm zu besuchen (zweifache RM-ANOVA, Haupteffekt von ELA: F1,22 = 21,82; *P < 0,05, **P < 0,01) ( B). Reduzierter belohnter Wechsel (%) in einer Kohorte von C57-ELA-Mäusen im Vergleich zu ihren Kontrollen (t22 = 5,00, **P < 0,01), was über eine T-Labyrinth-basierte Win-Shift-Aufgabe (C) festgestellt wurde. Beim Vergleich von C57-ELA-Mäusen mit Kontrollen wurde kein Unterschied in der im Zentrum verbrachten Zeit in einem Freilandtest (t22 = 0,43, P = 0,67) (D) oder der unbeweglichen Zeit in einem Schwimmstresstest (t22 =) beobachtet 0,16, P = 0,87) (E). F–H YFP-markierte Stacheln auf PrL-Pyramidenzellen. Repräsentatives konfokales Bild einer Thy1-YFPH-Kontrollmaus zur Verdeutlichung der analysierten dendritischen Segmente im PrL. Die eingerahmten Segmente in den Schichten II-III und V-VI wurden in G vergrößert, um dünne Stacheln (Pfeile) und pilzartige Stacheln (Pfeilspitzen) für Vergleiche mit einer ELA-Maus (H) darzustellen. Maßstabsbalken = 100 µm (F) und 8 µm (G, H). I–K Quantitative Analyse. Bei ELA-Mäusen war in den Schichten II-III und V-VI ein Wirbelsäulenverlust erkennbar (F1,12 = 40,30; **P < 0,01). Sowohl Pilztyp-Mäuse als auch dünne Stacheln waren bei ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen verringert (F1,22 = 13,66 bzw. 51,40 für Pilztyp-Mäuse und dünne Stacheln; *P < 0,05, **P < 0,01). L, M Es wurden positive Korrelationen zwischen dem spontanen Wechsel in einem T-Labyrinth und der Dichte der Gesamtstacheln in den Schichten II-III (Pearson r = 0,68, P < 0,05) und V-VI (r = 0,63, P < 0,05) beobachtet. Als dendritische Stacheln als pilzartige und dünne Stacheln klassifiziert wurden und ELA-Mäuse und Kontrolltiere getrennt analysiert wurden, wurde eine positive Korrelation zwischen dünnen Stacheln und spontanem Wechsel in beiden ELA-Gruppen beobachtet (r = 0,65 und 0,70 in II-III und V). -VI bzw. P < 0,05) und die Kontrollgruppe (r = 0,61 bzw. 0,59 in II-III bzw. V-VI, P < 0,05) (M).

Am Ende des Gedächtnistests wurden die Thy1-YFPH-Mäuse zur Wirbelsäulenzählung geerntet (Abb. 3F – K), gefolgt von einer Korrelationsanalyse (Abb. 3L, M). YFP-markierte dendritische Stacheln (Abb. 3F–H) wurden mithilfe eines unvoreingenommenen Fraktionatoransatzes stereologisch gezählt [54]. Wir haben uns auf die apikalen Dendriten konzentriert, da die Daten der Golgi-Färbung eine selektive Wirkung auf diese Zweige gezeigt haben. Wie in der Abbildung (Abb. 3I) gezeigt, war die Anzahl der Gesamtstacheln bei ELA-Mäusen geringer als bei den Kontrollen (Haupteffekt von ELA: F1,22 = 40,30, P < 0,0001; ELA × Schichtwechselwirkung: F1,22 =). 1,96, P = 0,1748). Sowohl dünne als auch pilzartige Stacheln waren bei ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen verringert (*P < 0,05, **P < 0,01) (Abb. 3J, K), im Einklang mit den Golgi-Wirbelsäulendaten. Der durch ELA verursachte Verlust von YFP-markierten Stacheln, insbesondere dünner Stacheln im PrL, korrelierte mit einer schlechten Gedächtnisleistung im Labyrinth (Abb. 3L, M). Insbesondere korrelierte der Prozentsatz spontaner Wechsel positiv mit der Gesamtzahl der Stacheln in den Schichten II-III und V-VI (Pearson r = 0,68 bzw. 0,63, P < 0,01) (Abb. 3L). Bei der getrennten Analyse der ELA-Mäuse und der Kontrollen wurde keine Korrelation festgestellt (ELA: r = 0,01 bzw. 0,14 in II-III bzw. V-VI; Kontrolle: r = 0,02 bzw. 0,14 in II-III bzw. V-VI; P > 0,05). Interessanterweise korrelierte die Dichte der dünnen Stacheln, nicht aber der pilzartigen Stacheln, positiv mit der T-Labyrinth-Leistung bei beiden ELA-Mäusen, wenn die Stacheln nach dünnen und pilzartigen organisiert waren (dünn: r = 0,65 und 0,70 in II-III). und V-VI, P <0,05) und Kontrollmäuse (dünn: r = 0,61 bzw. 0,59 in II-III und V-VI, P <0,05) (Abb. 3M). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass der Verlust der Wirbelsäule im PrL zu einer Beeinträchtigung des Arbeitsgedächtnisses bei ELA-Mäusen beiträgt und dass dünne Wirbelsäulen möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Leistung des Arbeitsgedächtnisses spielen.

Um die synaptische Grundlage des defekten Arbeitsgedächtnisses bei ELA-Mäusen zu verstehen, wurde die PrL-Subregion gesammelt, um das postsynaptische Protein PSD-95 und das präsynaptische Vesikelprotein p38 (Synaptophysin, Syn) am Ende des Gedächtnistests in einer Kohorte von C57-Mäusen zu bewerten (Abb. 4). Ähnlich wie bei Thy1-YFPH-Mäusen wiesen C57-ELA-Mäuse einen geringeren spontanen Wechsel auf als Kontrollen (54,17 ± 6,21 vs. 72,70 ± 5,28, n = 12; t22 = 7,87, P < 0,01). Proben aus dem PrL-Bereich wurden Western-Blot-Tests unterzogen, um die Proteingehalte von PSD-95 und Syn zu bestimmen (Abb. 4A – C). ELA-Mäuse hatten einen verringerten PSD-95-Wert (F1,22 = 8,994, P = 0,0066; Sidaks Post-Hoc-Test, **P < 0,01), aber vergleichbare Syn-Werte im Vergleich zu Kontrollen (Post-Hoc-Test, P = 0,83). PSD-95 und Syn wurden auf immunfärbenden Schnitten weiter untersucht (Abb. 4D–K), da ihre immunreaktiven (ir) Puncta als Marker für Synapsen gedient haben und PSD-95 sowohl auf dünnen als auch auf pilzartigen Stacheln nachgewiesen wurde [49]. , 56, 57]. Diese Puncta wurden stereologisch in den Schichten II-III und V-VI des PrL gezählt. Der Verlust von PSD-95-ir-Punkten wurde in gemessenen Schichten bei ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen festgestellt (F1,22 = 54,79, P < 0,0001; Post-hoc-Test, **P < 0,01). Die Größenverteilung der PSD-95-ir-Punkte deutete darauf hin, dass Synapsen bei 0,10–0,20 µm3 und 0,45–0,60 µm3 in den Schichten II-III (F1,22 = 27,61) und V-VI (F1,22 = 23,07) besonders betroffen waren. bzw. bei ELA-Mäusen (Post-hoc-Test, **P < 0,01, *P < 0,05). Es wurde kein Unterschied in der Anzahl (F1,22 = 4,47, P = 0,0459; Post-hoc-Test, P > 0,05) und Größenverteilung (F1,22 = 1,69, P = 0,2066 in den Schichten II-III; F1,22 = 1,56) festgestellt , P = 0,2244 in den Schichten V-VI) von Syn-ir puncta zwischen ELA- und Kontrollmäusen.

A–C Die Proteinspiegel von PSD-95 und dem präsynaptischen Vesikelprotein Syn im PrL. Die optischen Dichten der PSD-95- und Syn-Banden wurden auf die jeweiligen Aktinspiegel normalisiert und als Prozentsatz der Kontrollen ausgedrückt. ELA-Mäuse hatten eine verminderte Expression von PSD-95 (F1,22 = 8,994; **P < 0,01), aber nicht Syn (P = 0,83). D–K Wirkung von ELA auf synaptische Puncta im PrL. Repräsentative konfokale Z-Stack-Bilder (0,2 µm × 10) aus den Schichten V-VI von Kontroll- und ELA-Mäusen (D, E und G, H). Verringerte Anzahl der gesamten PSD-95-ir-Punkte in den Schichten II-III und V-VI bei ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen (F1,22 = 54,79; **P < 0,01) (F), aber begrenzter Einfluss von ELA auf Syn (F1 ,22 = 4,47; P > 0,05) (I). Die Größenverteilung der PSD-95-ir-Punkte (J, K) deutete auf einen Verlust von Synapsen hin, insbesondere bei einer Größe von 0,1–0,2 µm3 oder 0,45–0,60 µm3 bei ELA-Mäusen (Post-hoc-Test, *P < 0,05, **P). < 0,01). Maßstabsbalken = 5 µm (D, E und G, H). L, M Eine verringerte PSD-95-Expression korreliert mit einer schlechten Arbeitsgedächtnisleistung bei ELA-Mäusen. Es wurden positive Korrelationen zwischen dem spontanen Wechsel in einem T-Labyrinth und der Anzahl der gesamten PSD-95-ir-Punkte in den Schichten II-III (Pearson r = 0,69, P < 0,01) und V-VI (r = 0,62, P <) beobachtet 0,01) (L). Eine positive Korrelation wurde auch zwischen der Gedächtnisleistung und der Anzahl kleiner PSD-95-ir-Puncta (0,1–0,2 µm3) bei beiden ELA-Mäusen beobachtet (r = 0,62 und 0,58 in II-III bzw. V-VI, P < 0,05) und Kontrollmäuse (r = 0,60 und 0,71 in II-III bzw. V-VI, P < 0,05).

Die Korrelation zwischen PSD-95-ir puncta und Arbeitsgedächtnis wurde ausgewertet (Abb. 4L, M). Der Prozentsatz spontaner Wechsel in der Gedächtnisaufgabe wurde gegen die Anzahl der gesamten PSD-95-ir-Punkte in den Schichten II-III und V-VI aufgetragen. Die resultierende Korrelation zwischen PSD-95 und dem Wechsel der Wahl war hochsignifikant (r = 0,69 und 0,62 in den Schichten II-III bzw. V-VI, P <0,01) (Abb. 4L). Die Auswahllatenz bei T6 korrelierte auch signifikant mit PSD-95-ir-Punkten in den Schichten II-III (r = −0,64, P <0,01) und V-VI (r = −0,67, P <0,01), was die Beziehung zwischen Post und Post aufdeckte -synaptische Synapsen und Gedächtnisfunktion. Als die Daten von ELA-Mäusen und Kontrollen getrennt analysiert wurden, wurde keine Korrelation zwischen PSD-95 und spontanem Wechsel beobachtet (ELA: r = 0,08 und –0,16 in II-III bzw. V-VI, P > 0,05; Kontrollen: r). = 0,26 und 0,30 in II-III bzw. V-VI, P > 0,05). In Anbetracht der Tatsache, dass PSD-95-ir-Punkte in den Größen 0,10–0,20 µm3 und 0,45–0,60 µm3 wie oben beschrieben selektiv durch ELA beeinflusst wurden, wurden diese Punkta in kleine (≤ 0,20 μm3) und mittlere (0,25–0,40 μm3) unterteilt. und große (≥ 0,45 μm3) Größen in jeder Maus. Die kleinen Puncta korrelierten positiv mit dem Arbeitsgedächtnisindex sowohl bei ELA-Mäusen (r = 0,62 und 0,58 in II-III bzw. V-VI, P < 0,05) als auch bei Kontrollmäusen (r = 0,60 und 0,71 in II-III und V-VI). VI bzw. P < 0,05) (Abb. 4M). Die mittleren und großen Puncta korrelierten weder in der ELA- noch in der Kontrollgruppe mit der Gedächtnisleistung (alle P > 0,05). Diese Daten stimmen mit den Auswirkungen von ELA auf dendritische Stacheln im PrL überein und stützen die Annahme, dass ELA die Reifung von Stacheln und postsynaptischen Elementen im PrL unterbricht. Die positive Korrelation zwischen kleinen PSD-95-ir-Punkten und spontanem Wechsel in einzelnen Tiergruppen unterstützt die Bedeutung dendritischer Stacheln, insbesondere dünner Stacheln, für die Leistung des Arbeitsgedächtnisses.

Der durch ELA verursachte Verlust von Stacheln könnte die Expression von Glutamatrezeptoren auf PrL-Pyramidenzellen beeinträchtigen und zu einer veränderten glutamatergen Übertragung auf diesen Zellen führen. Um die AMPAR- und NMDAR-vermittelten synaptischen Ströme (EPSCs) zwischen ELA-Mäusen und Kontrollen zu vergleichen, wurden die Eingabe-/Ausgabekurven von AMPAR-EPSC und NMDAR-EPSC in einer Gruppe von Thy1-YFP-exprimierenden PrL-Pyramidenzellen in Schicht V erhalten -VI (Abb. 5A, B). AMPAR-EPSC und NMDAR-EPSC, die durch eine Reihe von Reizen mit erhöhter Intensität (von 5 V bis 9 V) induziert wurden, waren in den Pyramidenzellen von ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen deutlich reduziert (zweifache RM-ANOVA, F1,14 = 420,1 und 78,41 für). AMPAR- bzw. NMDAR-EPSC, P < 0,0001). AMPA-Ströme sanken um 34–58 %, wenn die Stimulation mit einer Intensität von 7–9 V durchgeführt wurde (Post-hoc-Test, **P < 0,01), und NMDA-Ströme wurden um 25–35 % bei einer Stimulationsintensität von 7–9 V reduziert. 9 V (**P < 0,01). Darüber hinaus hatten ELA-Mäuse eine reduzierte mEPSC-Amplitude (F1,28 = 69,99; Post-Hoc-Test, **P < 0,01) und Frequenz (F1,28 = 44,28; **P < 0,01) (Abb. 5C, D), was dies unterstützt der Beitrag postsynaptischer Komponenten zur verminderten glutamatergen Übertragung. Um die Proteinspiegel der AMPAR- und NMDAR-Untereinheiten in ELA-Mäusen mit denen von Kontrollen zu vergleichen, wurden am Ende der physiologischen Aufzeichnungen Schnitte mit PrL gesammelt und einem Western Blot unterzogen. ELA-Mäuse zeigten im Vergleich zu Kontrollen eine verringerte Expression der GluR1- und NR1-Untereinheiten (F1,14 = 20,00, P = 0,0005 und F1,14 = 4,87, P = 0,0445 für GluR1 bzw. NR1; Post-hoc-Test, **P < 0,01). ), wohingegen bei GluR2, NR2A oder NR2B kein Unterschied beobachtet wurde (Post-hoc-Test, P > 0,05) (Abb. 5E – G).

A, B Input-Output-Kurven von AMPAR-EPSC und NMDAR-EPSC als Reaktion auf eine Reihe von Reizen bei ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. ELA-Mäuse zeigten einen reduzierten EPSC, wenn die Stimulation bei 7 V und 9 V durchgeführt wurde (F1,14 = 420,1 bzw. 78,41 für AMPAR- bzw. NMDAR-EPSC, P < 0,0001; Post-Hoc-Test, **P < 0,01). Repräsentative EPSC-Spuren werden auf den rechten Feldern dargestellt. Die eingespannten Zellen wurden auf +60 mV depolarisiert, um NMDAR-EPSC aufzuzeichnen. Maßstabsbalken = 30 pA, 20 ms (A) und 30 pA, 100 ms (B). C, D Miniatur-EPSC (mEPSC)-Amplitude und -Frequenz wurden in den Schichten II-III und V-VI des PrL gemessen. Ein verminderter mEPSC war bei ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen erkennbar (F1,28 = 69,99 bzw. 44,28 für Amplitude und Frequenz; Post-hoc-Test, **P < 0,01). E–G Die Proteinspiegel der Untereinheiten AMPAR (GluR1 und GluR2) und NMDAR (NR1, NR2A und NR2B) im PrL von ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Die optischen Dichten der den Untereinheiten entsprechenden Banden wurden auf die jeweiligen Aktinspiegel normalisiert und als Prozentsatz der Kontrollen ausgedrückt. Es wurden verminderte Expressionen von GluR1 (F1,14 = 170,1, P < 0,0001; Post-Hoc-Test, **P < 0,01) und NR1 (F1,14 = 9,186, P = 0,009; Post-Hoc-Test, **P < 0,01) beobachtet in ELA-Mäusen (G).

Im Hinblick auf die verringerte glutamaterge Übertragung in den PrL-Pyramidenzellen von ELA-Mäusen untersuchten wir, ob die Anregung dieser Zellen die Gedächtnisleistung bei ELA-Mäusen verbessert. AAV2-DIO-hM3D(Gq)-mCherry-Viren wurden in das PrL einer Kohorte transgener Thy1-Cre-Mäuse injiziert, um die Erregbarkeit von PrL-Pyramidenzellen während Gedächtnistests selektiv zu erhöhen (Abb. 6). Eine robuste Expression von hM3D(Gq)-mCherry in den Thy1-exprimierenden Pyramidenzellen wurde sowohl bei Kontrollmäusen als auch bei ELA-Mäusen beobachtet (Abb. 6A – C), und die CNO-induzierte Aktivierung von Zellen wurde durch die Koexpression des unmittelbar frühen Gens dargestellt c-fos in diesen Gq-mCherry-exprimierenden Zellen (Abb. 6C). Die Verabreichung von CNO führte zu einer erhöhten Fos-Expression in den Schichten II-III und V-VI beider ELA-Mäuse (23,22 ± 2,40 vs. 86,56 ± 3,48 in Veh vs. CNO; n = 9) (Abb. 6D, E) und Kontrollen (21,88 ± 1,85 vs. 82,75 ± 4,43 in Veh vs. CNO; n = 8). Die Zwei-Wege-RM-ANOVA zeigte einen signifikanten Effekt der CNO-Behandlung (F1,15 = 403,9; Post-Hoc-Test, **P < 0,01 sowohl bei ELA- als auch bei Kontrollmäusen). Diese Daten deuten darauf hin, dass das hier verwendete erregende DREADD in der Lage ist, die Aktivität von Pyramidenzellen im PrL hochzuregulieren. Am wichtigsten ist, dass die Gq-basierte Aktivierung von PrL-Pyramidenzellen die Arbeitsgedächtnisleistung von ELA-Mäusen verbesserte (Abb. 6F – H). Die mit Gq-mCherry-Viren infizierten ELA-Mäuse, jedoch nicht die Kontrollmäuse, zeigten einen erhöhten Prozentsatz an spontanen Wechseln in einer T-Labyrinth-Aufgabe als Reaktion auf die CNO-Verabreichung (Haupteffekt von CNO: F1,15 = 29,33; Post-hoc-Test, * *P < 0,01 bei ELA-Mäusen, P = 0,51 bei Kontrollen) (Abb. 6F). Eine verringerte Wahllatenz bei T6 wurde bei ELA-Mäusen mit CNO im Vergleich zur Vehikelbehandlung beobachtet (F1,15 = 21,17; Post-hoc-Test, **P < 0,01) (Abb. 6G). Bemerkenswerterweise war die Gesamtzeit bis zum Abschluss der T0-T6-Versuche bei den Kontroll- und ELA-Mäusen mit oder ohne CNO vergleichbar (Haupteffekt von CNO: F1,15 = 0,799, P = 0,3855; Post-Hoc-Test, P > 0,05) (Abb . 6H). Zusätzliche ELA-Mäuse erhielten eine PrL-Injektion des Kontrollvirus AAV2-DIO-mCherry und dienten als Kontrolle für mögliche Off-Target-Effekte von CNO. Die Anwendung von CNO verbesserte das Arbeitsgedächtnis bei ELA-Mäusen mit dem Kontrollvektor nicht (Wechsel: t7 = 1,21, P = 0,26; Latenz: t7 = 0,74, P = 0,48) (Abb. 6I). Darüber hinaus veränderte CNO die in einem Freilandtest gemessene Fortbewegung nicht (F1,14 = 0,02, P = 0,90; Post-Hoc-Test, P > 0,05) (Abb. 6J) und löste in einem Schwimmtest keinen angstähnlichen Phänotyp aus ( F1,14 = 0,10, P = 0,75; Post-hoc-Test, P > 0,05) (Abb. 6K) bei Mäusen, die mit Gq-DREADDs behandelt wurden. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Anregung der PrL-Zellen in ELA, nicht jedoch in Kontrollmäusen, die Arbeitsgedächtnisleistung steigert.

A–C Der Ausdruck von AAV2-hM3D(Gq)-mCherry (braun) im PrL. Ein repräsentatives Bild zeigt, dass die mCherry-Expression speziell im PrL lokalisiert war. Das Bild wurde mit einer Kontrollmaus aufgenommen. AAV2-hM3D(Gq)-mCherry-DREADDs wurden über eine Glaspipette bei 6° schräg (ML = 0 mm) in die PrL von Thy1-Cre-transgenen Mäusen abgegeben. IL: infralimbisch; fmi: kleine Pinzette des Corpus callosum; ac: vordere Kommissur. B, C Überprüfung der CNO-Aktivierung von Thy1-Cre-exprimierenden Pyramidenzellen im PrL von ELA-Mäusen, die mit AAV2-hM3D(Gq) infiziert wurden. AAV2-infizierte Zellen (braun) exprimierten (Pfeilspitzen) Fos (schwarz) als Reaktion auf die CNO-Verabreichung. D, E Repräsentative Bilder zur Darstellung der CNO-induzierten Aktivierung von Zellen im PrL. Eine erhöhte Fos-Expression war bei ELA-Mäusen erkennbar, die mit CNO im Vergleich zu Vehikel behandelt wurden (Daten in den Ergebnissen gezeigt). Die CNO-induzierte Fos-Expression war auf das PrL beschränkt. Hirngewebe wurde 90 Minuten nach der CNO-Verabreichung entnommen. Die auf F–H DREADD basierende Aktivierung von PrL-Pyramidenzellen verbessert das Arbeitsgedächtnis von ELA-Mäusen. Thy1-Cre-Mäuse in der Kontroll- und ELA-Gruppe erhielten eine Injektion von AAV2-hM3D(Gq) in bilaterales PrL. CNO oder Kochsalzlösung (Veh) wurde 1 Stunde vor den Verhaltenstrainings- und Testsitzungen verabreicht. CNO hatte keinen Einfluss auf den spontanen Wechsel bei Kontrollmäusen, erhöhte jedoch den Prozentsatz des Wechsels bei ELA-Mäusen (F1,15 = 29,33; Post-hoc-Test, P = 0,51 bei Kontrollen und **P < 0,01 bei ELA-Mäusen) (F). Die ELA-Mäuse mit CNO-Verabreichung zeigten bei T6 eine verringerte Auswahllatenz im Vergleich zu Vehikelkontrollen (F1,15 = 21,17; Post-hoc-Test, **P < 0,01) (G). Es wurde kein Unterschied in der Gesamtzeit bis zum Abschluss der T1-T6-Versuche zwischen den vier Gruppen beobachtet (F1,15 = 0,799; Post-hoc-Test, P > 0,05) (H). Die Verabreichung von CNO verbesserte das Arbeitsgedächtnis bei ELA-Mäusen, die mit dem Kontrollvirus AAV2-DIO-mCherry infiziert waren, nicht (Alternation: t7 = 1,21, P = 0,26; Latenz: t7 = 0,74, P = 0,48). J, K CNO veränderte die in einem Freilandtest gemessene Fortbewegung nicht (Haupteffekt von CNO: F1,14 = 0,02, P = 0,90; Haupteffekt von ELA: F1,14 = 0,07, P = 0,79; Post-hoc-Test, alle P > 0,05) oder in einem erzwungenen Schwimmtest einen angstähnlichen Phänotyp hervorrufen (CNO-Effekt: F1,14 = 0,10, P = 0,75; ELA-Effekt: F1,14 = 0,28, P = 0,60; Post-hoc-Test, alle P > 0,05) sowohl bei Kontrollmäusen als auch bei ELA-Mäusen, die mit Gq-DREADDs behandelt wurden. Maßstabsbalken = 700 µm (A), 40 µm (B, C), 200 µm (linke Felder in D, E) und 30 µm (rechte Felder in D, E).

Unerwünschte Erfahrungen im frühen Leben können die Reifung der neuronalen Struktur stören und später im Leben zu einer fehlerhaften synaptischen Plastizität und kognitiven Funktion führen [1,2,3, 58]. Durch die Verwendung eines gut etablierten Tiermodells für ELA [7, 8, 45, 47], das durch die Veränderung der Käfigumgebung während der postnatalen Tage 2 bis 9 (P2–9), einer sensiblen Entwicklungsperiode, erzeugt wird, haben wir herausgefunden, dass ELA störend wirkt beeinträchtigt die mütterliche Fürsorge und führt zu erheblichem chronischem Stress bei den Welpen [45]. Hier hielten wir gestresste Welpen bis zum jungen Erwachsenenalter am Leben und untersuchten die Auswirkungen von ELA auf PrL-Pyramidenzellen und das frontalabhängige Arbeitsgedächtnis. Wir fanden heraus, dass ungünstige Erfahrungen bei P2–9 dauerhafte schädliche Auswirkungen auf die dendritischen Stacheln und postsynaptischen Ströme im PrL haben. Der durch ELA verursachte Verlust von Stacheln trat an selektiven dendritischen Segmenten der PrL-Pyramidenzellen in den Schichten II-III und V-VI auf und korrelierte mit einer Beeinträchtigung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses bei ELA-Mäusen. Weniger synaptische PSD-95-ir-Punkte bei ELA-Mäusen zeigten außerdem den Zusammenhang zwischen postsynaptischen Kontakten und dem Arbeitsgedächtnis. Mithilfe von Thy1-transgenen Mäusen, in denen eine Gruppe von PrL-Pyramidenzellen YFP exprimiert, haben wir AMPAR- und NMDAR-vermittelte synaptische Ströme (EPSCs) gemessen und bei ELA-Mäusen eine verminderte glutamaterge Übertragung und eine verminderte Expression der GluR1- und NR1-Untereinheiten festgestellt. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Aktivierung von Thy1-exprimierenden PrL-Pyramidenzellen über exzitatorische DREADDs die Gedächtnisleistung von ELA-Mäusen in einer T-Labyrinth-basierten spontanen Wechselaufgabe verbessern kann. Diese Daten legen nahe, dass die Integrität dendritischer Stacheln auf frontalen Pyramidenzellen für die Aktivierung dieser Zellen und die frontale kortexabhängige Gedächtnisfunktion von wesentlicher Bedeutung ist.

Der Nagetier-PFC besteht aus der PrL und mehreren anderen Unterregionen. Unter diesen Unterregionen ist die PrL an der Verarbeitung einer Vielzahl kognitiver und emotionaler Reize beteiligt. Studien haben gezeigt, dass die Aktivierung von PrL-Pyramidenzellen für die Leistung des Arbeitsgedächtnisses notwendig ist [59,60,61]. Frühe Berichte an Nagetieren haben gezeigt, dass Läsionen des PrL zu ausgeprägten Defiziten bei Aufgaben mit verzögerter Reaktion führen [59, 60]. Daten aus einer Kombination aus exzitotoxischen Läsionen, lokaler Inaktivierung und Optogenetik deuten darüber hinaus darauf hin, dass die frontale Aktivität von entscheidender Bedeutung ist, wenn die Anforderungen an das Arbeitsgedächtnis hoch sind [61]. Aufgrund seiner zentralen Rolle im Arbeitsgedächtnis und in den exekutiven Funktionen wird angenommen, dass das PrL als zentraler Knotenpunkt im Schaltkreis des Gehirns fungiert und Symptome psychiatrischer Störungen wie Depression und Schizophrenie vermittelt [20, 62, 63]. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass früher postnataler Stress die PrL-Pyramidenzellen und das Arbeitsgedächtnis beeinträchtigt. Die ELA-Mäuse verbrachten mehr Zeit mit der Entscheidungsfindung beim Betreten eines Zielarms und zeigten eine geringere Rate spontaner Wechsel bei einer T-Labyrinth-basierten Aufgabe, die Berichten zufolge sehr empfindlich auf frontale Dysfunktionen reagierte [50, 51]. Bemerkenswert ist, dass ELA-bedingte Arbeitsgedächtnisdefizite über die T-Labyrinth-Spontanalternationsaufgabe bei C57-Wildtyp-Mäusen und zwei Stämmen transgener Thy-1-Mäuse stabil nachgewiesen werden konnten. In einem T-Labyrinth-basierten Win-Shift-Test wurde auch bei jungen erwachsenen C57-Mäusen mit einer ELA-Erfahrung ein verringerter belohnter Wechsel beobachtet. Diese Verhaltensdaten stehen im Einklang mit einer Reihe früherer Studien an Tieren und Menschen, die die schädlichen Auswirkungen von akutem und chronischem Stress auf die Leistung des Arbeitsgedächtnisses belegen [z. B. 64,65,66,67].

Dendritische Stacheln auf Pyramidenzellen stellen die postsynaptischen Stellen des glutamatergen erregenden Inputs dar und spielen eine zentrale Rolle bei der Verarbeitung synaptischer Informationen und kognitiver Funktionen [68,69,70]. Diese Stacheln können in dünne, pilzartige und stämmige Stacheln eingeteilt werden [49, 56, 57]. Die Daten der vorliegenden Studie legen nahe, dass dünne (~ 62 % aller Stacheln) und pilzartige (~ 37 %) Stacheln die vorherrschenden Subtypen im PrL sind. Dünne Stacheln sind äußerst dynamisch, und Studien deuten darauf hin, dass sie zum Arbeitsgedächtnis, einer Form des Kurzzeitgedächtnisses, beitragen, wahrscheinlich durch den schnellen Umbau synaptischer Kontakte und den Zusammenbau von Rezeptoren [33,34,35]. Pilzartige Stacheln sind stabiler und an der Aufrechterhaltung langanhaltender Veränderungen der synaptischen Übertragung beteiligt, die für die Gedächtniskonsolidierung erforderlich sind [35, 71]. Es wird angenommen, dass Veränderungen in der Anzahl und Art der Stacheln Veränderungen in den synaptischen Kontakten und der neuronalen Aktivität offenbaren, die sich auf die Verhaltensergebnisse auswirken. Im PrL kann der durch ELA verursachte Verlust der Stacheln zu einer Beeinträchtigung des Arbeitsgedächtnisses bei ELA-Mäusen beitragen. Studien haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber chronischem und/oder schwerem Stress während einer frühen postnatalen Periode die Entwicklung frontaler Pyramidenzellen stört [10, 65]. Bei der Aufzucht der Welpen in einer veränderten Käfigumgebung während der postnatalen Tage 2–9 kommt es zu einer selektiven Regression Über apikale Dendriten frontaler Pyramidenzellen wurde berichtet [10]. In der vorliegenden Studie haben wir herausgefunden, dass diese Art von negativen Erfahrungen im frühen Leben eine dauerhafte Wirkung auf die Stacheln der PrL-Pyramidenzellen hat. An den apikalen Dendriten von Pyramidenzellen in den Schichten II-III oder V-VI wurde ein Verlust von Stacheln, einschließlich dünner und pilzartiger Stacheln, festgestellt. Insbesondere wurde eine positive Korrelation zwischen dem spontanen Wechsel bei einer T-Labyrinth-Aufgabe und der Dichte der gesamten Stacheln auf den PrL-Pyramidenzellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass der Verlust dendritischer Stacheln im PrL die Gedächtnisleistung bei ELA-Mäusen beeinträchtigt. Interessanterweise wurde bei der alleinigen Untersuchung der ELA- oder Kontrollgruppe kein Zusammenhang zwischen der Gesamtwirbelsäulendichte und der T-Labyrinth-Leistung gefunden. Wenn die Stacheln jedoch in dünne oder pilzartige Stacheln unterteilt und separat analysiert wurden, korrelierten dünne Stacheln sowohl in der ELA- als auch in der Kontrollgruppe mit der T-Labyrinth-Leistung. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die schlechte Leistung von ELA-Mäusen bei der T-Labyrinth-Aufgabe größtenteils auf den Verlust dünner Stacheln zurückzuführen ist. Diese Beobachtungen stimmen gut mit Studien an Tieren und Menschen überein, die schädliche Auswirkungen von chronischem Stress auf die Leistung des Arbeitsgedächtnisses berichten [64, 65, 67] und den großen Beitrag dünner Stacheln zum Arbeitsgedächtnis belegen [33, 34, 35]. Diese Daten stimmen auch mit Studien zu anderen Gehirnregionen überein. Beispielsweise zeigen Pyramidenzellen im Hippocampus bei Mäusen, die frühem Stress ausgesetzt waren, sowie bei Mäusen und Ratten, die akutem oder chronischem Stress ausgesetzt waren, einen Verlust von Stacheln an ausgewählten dendritischen Ästen [6, 8, 56, 72]. Es wurde berichtet, dass der Verlust der Wirbelsäule im Hippocampus zu dem bei den ELA-Mäusen beobachteten Defizit im räumlichen Gedächtnis beiträgt [9]. Insbesondere wurde das räumliche Gedächtnis über eine Objektlokalisierungsaufgabe bewertet, die auf der Aktivität des dorsalen Hippocampus beruht. Es liegen widersprüchliche Daten vor, wenn Stress in Form einer mütterlichen Trennung entstand [73,74,75,76]. Es ist erwähnenswert, dass die Trennung von der Mutter deutliche Auswirkungen auf die neuronale Differenzierung und Reifung der Stacheln im medialen PFC haben kann [77] und dass die Auswirkungen von Stress auf die dendritische Differenzierung weitgehend vom Zeitfenster der Stressexposition abhängen [1, 78]. .

Wir haben hier berichtet, dass der durch ELA verursachte Verlust der Stacheln in einer räumlich begrenzten Region am deutlichsten war. Die ELA-Mäuse zeigten einen enormen Verlust an Stacheln auf selektiven dendritischen Segmenten der PrL-Pyramidenzellen in den Schichten II-III oder V-VI. Insbesondere wurde bei ELA-Mäusen ein Verlust von dünnen und pilzartigen Stacheln an den apikalen, aber nicht an den basalen Dendriten beobachtet, und dieser Verlust beschränkte sich auf dendritische Segmente, die 200–280 µm vom Soma der Pyramidenzellen in den Schichten II–III entfernt waren 160–240 µm aus dem Soma der Pyramidenzellen in den Schichten V–VI. Unsere unveröffentlichten Daten aus Verfolgungsstudien legen nahe, dass diese Stacheln die postsynaptischen Ziele von Zellen aus dem ventralen Hippocampus und der basolateralen Amygdala sein könnten. Es wurde berichtet, dass eine Störung der Hippocampus-Eingänge in den medialen PFC zu einem schlechteren Arbeitsgedächtnis bei schizophrenen Patienten und Mausmodellen führt [79, 80]. Aktuelle Daten deuten außerdem darauf hin, dass der PFC dynamisch mit dem Hippocampus interagiert und Hippocampus-assoziierte Gedächtnisinformationen in präfrontal-assoziierte Aktionen übersetzt [13]. Dementsprechend stellt die entwicklungsbedingte Rettung der präfrontal-hippocampalen Kommunikation in einem Mausmodell für psychische Erkrankungen Arbeitsgedächtnisdefizite wieder her [81]. Daher ist die ordnungsgemäße Entwicklung der Stacheln auf frontalen Pyramidenzellen von entscheidender Bedeutung für die kognitiven Fähigkeiten, und der Verlust der Stacheln auf diesen Zellen kann während der Entwicklung zu einer abnormalen Kommunikation zwischen Präfrontal und Hippocampus führen, was dauerhafte Folgen für die kognitive Leistung haben kann. Hier fanden wir heraus, dass die durch Synaptophysin repräsentierten präsynaptischen Puncta im PrL von ELA-Mäusen nur begrenzt betroffen waren. Es ist jedoch nicht bekannt, ob sich der Verlust der Stacheln im PrL speziell auf die Quellen der präsynaptischen Endigungen aus dem Hippocampus und/oder der Amygdala auswirkt. Weitere Studien sind erforderlich, um diese grundlegenden Fragen zu beantworten und die unterschiedlichen funktionellen Auswirkungen dieser frontalen Afferenzen als Reaktion auf Widrigkeiten im frühen Leben zu verstehen.

Obwohl die Mechanismen, durch die ELA den Verlust sowohl dünner als auch pilzartiger Stacheln an bestimmten dendritischen Segmenten von PrL-Pyramidenzellen hervorruft, noch nicht erforscht wurden, führt der Verlust von Stacheln zu einer Verringerung der gesamten postsynaptischen Fläche erregender Synapsen und zur Bildung von Formrezeptoren, was zu … veränderte synaptische Ströme [82, 83]. In der vorliegenden Studie war bei ELA-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen ein verringerter PSD-95-Spiegel erkennbar, das präsynaptische Protein Syn blieb jedoch zwischen den beiden Gruppen vergleichbar. PSD-95 ist ein Gerüstprotein, das sich gleichmäßig über die gesamte Ausdehnung der synaptischen aktiven Zone verteilt und an allen asymmetrischen Synapsen gefunden wurde. Die stereologische Quantifizierung prä- und postsynaptischer Puncta identifizierte außerdem die selektive Wirkung von ELA auf postsynaptische Elemente von PrL-Pyramidenzellen in den Schichten II-III und V-VI. Diese Daten stimmen mit den Berichten von Tiermodellen mit wiederholtem oder chronischem unvorhersehbarem Stress überein, in denen eine verminderte Expression synaptischer Proteine ​​und verminderte exzitatorische synaptische Ströme in frontalen Pyramidenzellen der gestressten Tiere beobachtet wurden [84, 85]. Es wurde berichtet, dass PSD-95 entscheidend an der Rekrutierung von AMPA-Rezeptoren für erregende Synapsen beteiligt ist [86]. Während der Entwicklung kann eine Herunterregulierung der Expression von PSD-95 die Anzahl synaptischer AMPA- und NMDA-Rezeptoren verringern, die AMPA-Rezeptor-vermittelte synaptische Übertragung unterdrücken und frontal-assoziiertes Verhalten stören [86, 87]. Um zu verstehen, ob der Verlust von Stacheln auf PrL-Pyramidenzellen die erregende glutamaterge Übertragung beeinflusst, wurden AMPA- und NMDA-Rezeptor-vermittelte synaptische Ströme (EPSCs) in einer Gruppe von Thy1-exprimierenden PrL-Pyramidenzellen aufgezeichnet. Eine verminderte glutamaterge Übertragung, die postsynaptisch abhängig ist, wurde bei ELA-Mäusen durch eine verringerte Amplitude und Frequenz von Miniatur-EPSCs identifiziert. Gleichzeitig wurde bei den ELA-Mäusen eine verminderte Expression der GluR1- und NR1-Untereinheiten beobachtet. Studien haben gezeigt, dass GluR1 und NR1 zwei Schlüsselakteure bei der Steuerung der synaptischen Übertragung sind [35, 71]. Diese Untereinheiten sind an glutamatergen Synapsen angereichert, wo sie in der postsynaptischen Dichte (PSD) dendritischer Stacheln sitzen. Es wurde vorgeschlagen, dass die intakte Struktur der Stacheln ein entscheidender Faktor für die synaptische Übertragung ist, indem sie den Handel und die Aktivierung von Glutamatrezeptoren kontrolliert [35, 36, 68]. Daher kann der an den Pyramidenzellen beobachtete Verlust von Stacheln zu verminderten EPSCs und einer verringerten Expression von AMPA- und NMDA-Untereinheiten im PrL beitragen. Zusammengenommen könnten Veränderungen in den postsynaptischen Glutamatrezeptor-Untereinheiten und der synaptischen Übertragung die normalen synaptischen Kontakte und die Funktion der PrL-Pyramidenzellen verändert haben, was eine neurobiologische Grundlage für die nachgewiesenen nachteiligen Auswirkungen von ELA auf das räumliche Arbeitsgedächtnis darstellt [58].

In Anbetracht der Tatsache, dass die PrL-Pyramidenzellen von ELA-Mäusen eine verringerte glutamaterge Übertragung aufwiesen, untersuchten wir, ob eine Hochregulierung der Aktivierung dieser Pyramidenzellen ELA-bedingte Gedächtnisdefizite wiederherstellt. Wir verwendeten transgene Thy1-Cre-Mäuse, in denen eine Gruppe von PrL-Pyramidenzellen den Thy1-Promotor exprimierte. Während des Gedächtnistests können diese Thy1-exprimierenden Pyramidenzellen selektiv über einen Cre-abhängigen Gq-exzitatorischen DREADD-Ansatz aktiviert werden, der durch Post-hoc-Erkennung der Fos-Koexpression in allen hM3D(Gq)-mCherry-exprimierenden Zellen verifiziert wird. Um sicherzustellen, dass die Gq-DREADD-Vektoren spezifisch in die PrL abgegeben wurden, wurde eine für die stereotaktische Injektion verwendete Glaspipette auf ±6° schräg (ML = 0 mm) eingestellt. Die postoperativen Untersuchungen zeigten, dass Zellen im cingulären Kortex und in den Bereichen rund um den PrL weniger von den Vektoren betroffen waren. In der Studie wurde CNO verabreicht, um die Thy1-Cre-exprimierenden PrL-Pyramidenzellen während einer T-Labyrinth-Aufgabe zu stimulieren [50, 51]. Bei ELA-Mäusen mit CNO-Verabreichung wurde ein erhöhter Prozentsatz spontaner Wechsel und eine verringerte Wahllatenz bei T6 in der Aufgabe beobachtet, was auf ein verbessertes Arbeitsgedächtnis hinweist. Es ist nicht bekannt, ob eine durch chemogenetische Aktivierung induzierte Verbesserung des Arbeitsgedächtnisses mit einer erhöhten Wirbelsäulendichte verbunden ist. Es sind Studien erforderlich, um diesen wichtigen Punkt anzugehen und die Wirkung der chemogenetischen Aktivierung auf die synaptische Übertragung zu verstehen. Bemerkenswert ist, dass diese Ergebnisse nicht auf Off-Target-Effekte von CNO zurückzuführen waren, da das Kontrollvirus AAV2-DIO-mCherry keinen Einfluss auf die Gedächtnistests hatte und die CNO-induzierte spezifische Aktivierung von hM3D(Gq)-exprimierenden Pyramidenzellen bestätigt wurde durch Koexpression von Fos im PrL. Diese Daten stützen die Möglichkeit, dass chemogenetische Strategien, die eine Hochregulierung der Zellaktivierung beinhalten, die Gedächtnisdefizite wiederherstellen könnten, die häufig nach Entwicklungsstressoren beobachtet werden.

Zusammenfassend deuten die hier präsentierten Daten darauf hin, dass negative Erfahrungen in jungen Jahren dauerhafte Auswirkungen auf die dendritischen Stacheln und postsynaptischen Kontakte der PrL-Pyramidenzellen haben, was sich nachteilig auf die glutamaterge Übertragung und das frontalabhängige Arbeitsgedächtnis auswirkt. Eine Hochregulierung der Aktivierung von PrL-Pyramidenzellen kann die Leistung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses bei Mäusen, die in jungen Jahren Widrigkeiten erlebt haben, effizient verbessern und so die Bedeutung der Integrität der dendritischen Struktur auf frontalen Pyramidenzellen weiter aufdecken.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81871004; DL), den Discipline Construction Funds der Guangzhou Medical University (Basic Medicine, Nr. 02-410-2206145 und 06-410-2107295; DL) und High-Level unterstützt Baufonds der Medizinischen Universität Guangzhou (Nr. 195002002033; DL).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Liping Xu; Yue Liu; Jingyi Long.

Schlüssellabor für Neurowissenschaften, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, 511436, China

Liping Xu, Yue Liu, Xiulan He, Fanbing Xie, Qiao Yin und Dahong Long

Abteilung für Humangenetik, Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University Medical Center, 6525GA, Nijmegen, Niederlande

Jingyi Long

University of California, Los Angeles, CA, 90095, USA

Michael Chen

Abteilung für Pädiatrie, University of California, Irvine, CA, 92697, USA

Yucai Chen

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DL und YC entwarfen Forschung; LX, YL, JL, XH, FX und QY führten Untersuchungen durch; LX, JL und MC analysierten Daten; und LX, DL und YC haben den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Dahong Long oder Yuncai Chen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xu, L., Liu, Y., Long, J. et al. Der Verlust von Stacheln in der prälimbischen Kortikalis wirkt sich nachteilig auf das Arbeitsgedächtnis bei Mäusen aus, die unter frühkindlichen Beeinträchtigungen leiden. Mol Psychiatrie (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-02197-7

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Eingegangen: 22. November 2022

Überarbeitet: 19. Juli 2023

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 27. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-02197-7

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