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Aug 19, 2023

Übereinstimmung zwischen Kultur, Molekularkultur und Illumina 16S rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung von Knochen- und Ulkusbettbiopsien bei Menschen mit diabetischer Fußosteomyelitis

BMC Infectious Diseases Band 23, Artikelnummer: 505 (2023) Diesen Artikel zitieren 188 Zugriffe Metrikdetails In der klinischen Praxis basiert die Diagnose der diabetischen Fußosteomyelitis (DFO) auf Kulturen

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Details zu den Metriken

In der klinischen Praxis stützt sich die Diagnose einer diabetischen Fußosteomyelitis (DFO) auf Knochenkulturen oder Ulkusbettbiopsien (UB), wobei die Knochenbiopsie der Referenzstandard ist. Das langsame Wachstum oder die anspruchsvolle Natur einiger Bakterien erschweren eine schnelle Erkennung und Identifizierung. Schnelle molekulare Techniken könnten beide Probleme lösen, ihr zusätzlicher Nutzen für die alltägliche Praxis ist jedoch unbekannt.

Wir untersuchten die Übereinstimmung zwischen konventioneller Kultur, den molekularen Techniken Molecular Culture (MC) und der Sequenzierung des illumina 16S rRNA-Gen-Amplikons (16S) bei Menschen mit DFO.

In der BeBoP-Studie wurden Knochen- und UB-Biopsien von Menschen mit DFO entnommen, die das Amsterdam UMC besuchten. Diese Biopsien wurden unter Verwendung von 1) konventioneller Kultur, 2) MC, einer schnellen Breitband-PCR zur Analyse der ribosomalen Zwischenraumregion 16S-23S und 3) 16S-Sequenzierung analysiert und die Übereinstimmung dieser Techniken bewertet.

Wir haben 20 Proben (11 Knochen und 9 UB) von 18 Personen analysiert. Insgesamt wurden 84 Infektionserreger identifiziert, 45 (54 %) durch alle Techniken, weitere 22 (26,5 %, insgesamt 80,5 %) durch MC und 16S und die restlichen 16 Arten durch Kultur und MC oder 16S oder durch a Nur Einzelmethode. MC und 16S identifizierten Anaerobier, die durch Kultivierung in 5 Proben nicht nachgewiesen wurden, und das Vorhandensein von Bakterien in 7 von 8 kulturnegativen Proben (6 Knochen, 2 UB).

Das hohe Maß an Übereinstimmung zwischen MC und 16S und die zusätzliche Fähigkeit molekularer Techniken, verschiedene Bakterien nachzuweisen, die durch Kultivierung nicht nachgewiesen werden können, eröffnen Perspektiven für den routinemäßigen Einsatz schneller molekularer Techniken in klinischen Umgebungen, einschließlich DFO.

Die BeBoP-Studie wurde rückwirkend am 05.03.2019 im niederländischen Studienregister registriert: NL 7582.

Peer-Review-Berichte

Diabetische Fußosteomyelitis (DFO) ist eine schwere Infektion, die bei Menschen mit Diabetes und Fußgeschwüren die Hauptursache für Amputationen der unteren Gliedmaßen ist, wenn sie nicht umgehend behandelt wird. Eine schnelle klinische Identifizierung aller verursachenden Bakterien bei DFO, die für eine fundierte Entscheidung über zielgerichtete Antibiotika erforderlich ist, ist jedoch eine Herausforderung. Die erste Hürde besteht darin, Proben ordnungsgemäß zu entnehmen, ohne dass es zu einer externen Kontamination kommt. Obwohl häufig verwendet, sind Abstrichproben zur Kultivierung Biopsien unterlegen [1,2,3] und eine positive Kultur einer perkutan (oder chirurgisch) aseptisch gewonnenen Knochenprobe gilt als Beweis für das Vorliegen einer Osteomyelitis [4]. Ob Knochenkulturen oder Ulkusbettbiopsien zu besseren Ergebnissen führen, wird derzeit in einer großen internationalen multizentrischen BonE BiOPsy (BeBoP)-Studie untersucht [5]. Die Kultivierung der gewonnenen Proben ist derzeit der Referenzstandard für den Bakteriennachweis [4]. Zu den Vorteilen der Kultivierung gehört die Möglichkeit, eine direkte Mikroskopie durchzuführen und die antimikrobielle Empfindlichkeit zu testen. Die Ergebnisse zur antimikrobiellen Empfindlichkeit ermöglichen eine gezielte Antibiotikatherapie. Zu den Einschränkungen gehört jedoch, dass 1) die Kultivierungsmethode auf Bakterienwachstum beruht und nicht auf der Untersuchung des tatsächlichen Ausgangsmaterials, 2) dass es mehrere Tage dauert, bis Ergebnisse erzielt werden, insbesondere bei langsam wachsenden Organismen, und 3) dass einige (anspruchsvolle) Bakterien dies möglicherweise nicht tun wachsen und bleiben daher sogar unentdeckt [6,7,8]. Diese Einschränkungen beeinträchtigen die Geschwindigkeit, mit der zielgerichtete Antibiotika verabreicht werden können, und können zu falsch negativen Ergebnissen führen, da Bakterien, die zwar vorhanden sind, aber nicht kultiviert werden konnten, nicht gemeldet und somit unbehandelt bleiben. Dies wiederum kann zu einer okkulten Restinfektion führen und letztendlich das Risiko unerwünschter Folgen erhöhen.

Molekulare Techniken, insbesondere schnelle molekulare Techniken, könnten die Empfindlichkeit der Identifizierung des Vorhandenseins von Bakterien erhöhen. Diese Techniken basieren nicht auf Bakterienwachstum, sondern weisen das Vorhandensein bakterieller Desoxyribonukleinsäure (DNA) (dh Ausgangsmaterial) direkt aus einer Probe nach. Diese Technik ist auch dann von Vorteil, wenn eine Probe möglicherweise schwer zu kultivierende Bakterien enthält und somit zu einer schnelleren Identifizierung und Behandlung von DFO beitragen kann.

Eine dieser molekularen Techniken ist die 16S-Gen-Amplikonsequenzierung (16S) der ribosomalen Ribonukleinsäure (rRNA) von Illumina, die eine 16S-Region der isolierten ribosomalen DNA durch Polymerasekettenreaktionen (PCR) amplifiziert, die auf hypervariable Regionen abzielen; Primer werden üblicherweise zur Amplifikation der V1-V2- oder V3-V4-Regionen verwendet [9]. Diese Technik weist eine relativ langsame Ausgabegeschwindigkeit auf, da Proben zur Kostenreduzierung gemeinsam analysiert (gemultiplext) werden und molekulare Analysen von Proben mit geringer mikrobieller Biomasse (wie es bei DFO-Proben der Fall ist) durch die Kontamination von Reagenzien und Sequenzierungsmaschinen behindert werden [10].

Molekularkultur (MC) ist eine weitere molekulare Technik und relativ neu. Diese schnelle Technik verwendet fluoreszierend markierte PCR-Primer, um zwischen Bakterienarten durch Identifizierung der Länge der Inter Space (IS)-Region des 16S-23S-rRNA-Gens zu unterscheiden. Mit dieser Technik können einzelne Proben analysiert werden, die innerhalb von Stunden Ergebnisse liefern [11]. MC bietet daher mehrere Vorteile gegenüber der 16S-Sequenzierung, zu denen vor allem die Möglichkeit gehört, einzelne Proben statt Batch-Analysen durchzuführen und Ergebnisse innerhalb von Stunden zu erhalten sowie möglicherweise eine höhere taxonomische Auflösung. Dieser letztgenannte Vorteil hängt jedoch mit seinem Hauptnachteil im Vergleich zur 16S-Sequenzierung zusammen, nämlich der Abhängigkeit von der Referenzbibliothek. Repräsentative 16S-Sequenzen von ASVs werden unabhängig von der Referenzbibliothek generiert und können anschließend analysiert werden, um auf ihre Identität zu schließen. MC benötigt eine eigene Referenzbibliothek; eine, die jedoch kontinuierlich erweitert wird. Darüber hinaus liefert die 16S-Sequenzierung normalerweise Daten zur Zusammensetzung. Bei der Analyse infizierten Gewebes, bei der die binäre Analyse zum Nachweis (Anwesenheit/Abwesenheit) von Infektionserregern das Hauptziel ist, stellt dies jedoch nur einen geringen Mehrwert dar.

In dieser Studie wollten wir Bakterien in DFO-Knochen- und Geschwürbett-(Gewebe-)Proben (mit geringer mikrobieller Biomasse) mithilfe konventioneller Kultivierungstechniken und der molekularen Techniken MC (InBiome bv, Amsterdam, Niederlande) und 16S-Sequenzierung (Microbiota Centre Amsterdam) genau nachweisen , Niederlande) [9, 11]. Daher haben wir die Ergebnisse der konventionellen Kultivierung, MC- und 16S-Sequenzierung, von Knochen- und UB-Gewebebiopsien von Menschen mit DFO verglichen, die an der internationalen multizentrischen, randomisierten, kontrollierten BonE BioPsy (BeBop)-Studie teilgenommen haben [5].

Die BeBoP-Studie ist eine internationale multizentrische, randomisierte, kontrollierte Studie, für die Einschlüsse von 2018 bis 2022 laufen. In der BeBoP-Studie vergleichen wir die Ergebnisse der DFO-Behandlung auf der Grundlage zweier diagnostischer Strategien, perkutaner Knochenbiopsie und Ulkusbettbiopsiekulturen. Nur die Ergebnisse einer dieser Methoden waren für den behandelnden Arzt entblindet [5]. Zu Beginn der Studie wurden sowohl Knochen- als auch Ulkusbettproben entnommen und kultiviert. Außerdem wurde das Material beider Proben bei -80 °C gelagert. In der vorliegenden Studie haben wir die aufgetauten, nicht verblindeten Proben der ersten 18 Teilnehmer dieser BeBoP-Studie analysiert [5].

Knochen- und Geschwürbettproben wurden mit herkömmlichen Kultivierungstechniken auf Bakterien gemäß den Standardarbeitsanweisungen des Labors des Amsterdam University Medical Centers untersucht. Zu diesen Verfahren gehörten eine Gram-Färbung, die Inokulation von Bakterien auf Columbia-Agar + 5 % Schafsblut (COS) und Schokoladenagar (PVX), inkubiert bei 35–37 °C unter aeroben Bedingungen mit Kohlendioxid (CO2). Bei allen Proben wurden anaerobe Kulturen durchgeführt, d. h. die Inokulation von Bakterien auf COS, die 4 Tage lang anaerob bei 35–37 °C inkubiert wurden. Um die Empfindlichkeit zu erhöhen, wurden die Proben in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI) gegeben, 7 Tage lang beimpft und täglich untersucht, um das Wachstum zu bewerten. Im Falle eines Bakterienwachstums in BHI wurden Bakteriensubkulturen auf PVX und COS geimpft, bei 35–37 °C mit CO2 und unter anaeroben Bedingungen inkubiert.

Alle morphologisch unterschiedlichen Bakterienkolonien wurden mit Matrix-unterstützter Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF, Bruker Microflex LT, Bruker, London, UK) auf Artenebene charakterisiert. Die Antibiotikaempfindlichkeit wurde mittels Scheibendiffusion oder Vitek2 (Biomérieux, Frankreich) getestet und gemäß den klinischen Grenzwerten des Europäischen Komitees für antimikrobielle Suszeptibilitätstests (EUCAST) bewertet.

Wir führten eine molekulare Diagnostik an denselben Knochen- und Ulkusbettproben durch. Die DNA-Isolierung ist der erste Schritt sowohl für die MC- als auch für die 16S-Sequenzierung.

Wir haben die Proben vor Beginn des DNA-Extraktionsprozesses aufgetaut. Knochen- und UB-Proben wurden in Stücke von 3 × 3 mm zerlegt und in ein Reaktionsröhrchen mit 500 µl Bacterial Shock Buffer 1 (InBiome, IBB23000) und 400 mg Zirconia/Silica Beads, 0,1 mm (Biospec, 11079101Z) gegeben. Die Proben wurden gevortext und bei 95 °C unter Schütteln bei 800 U/min 10 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden 50 µl Bacterial Shock Buffer 2 (inBiome, IBB24000) hinzugefügt und die Röhrchen kurz zentrifugiert. Das Perlenschlagen wurde 180 s lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Perlenschlagen wurden die Röhrchen zentrifugiert und der Überstand zusammen mit 1 ml Lysepuffer (Biomérieux, Macy l'Etoile, Frankreich) und 1 ml AL-Puffer (Qiagen, 19.075) in einen easyMAG-Behälter (Biomérieux) gegeben. Wir haben alle Proben mindestens 10 Minuten lang inkubiert, bevor wir 70 µl Magnetic Silica (Biomérieux) hinzugefügt haben. Wir führten die DNA-Extraktion auf der automatisierten DNA-Isolierungsmaschine NucliSENS easyMAG (Biomérieux) mit dem spezifischen Protokoll durch, wie vom Hersteller beschrieben. Die DNA wurde in einem 70-µl-Puffer eluiert und vor der MC- und 16S-Sequenzierung bei 4 °C gelagert.

Die Molekularkultur ist eine von InBiome patentierte molekulare Technik. Zur Durchführung dieser Technik verwendeten wir die isolierte DNA zum Nachweis und zur Identifizierung von Bakterien mit dem CE/IVD-gekennzeichneten MC-Assay (MC-ID, Inbiom, Nummer: MolCul15000.inBiome). Kurz gesagt, wir verwendeten fluoreszierend markierte PCR-Primer, um zwischen Bakterienarten durch Identifizierung der Länge der Inter Space (IS)-Region des 16S-23S-rRNA-Gens zu unterscheiden. Diese IS-Region wurde in zwei Multiplex-PCRs unter Verwendung eines Veriti 96 PCR-Systems (Applied Biosystems) amplifiziert. Die erste PCR wurde verwendet, um Arten aus den Stämmen Bacteriodetes, Firmicutes, Actinobacteria, Fusobacteria und Verrucomicrobia zu identifizieren. Die zweite PCR wurde verwendet, um Arten aus dem Proteobacteria-Stamm zu identifizieren.

Nach der Amplifikation fügten wir 20 μl eMix (inBiome) mit jeweils 2,5 μl der beiden PCR-Produkte hinzu. Wir verwendeten einen Applied Biosystems (ABI) Prism 3500 Genanalysator, um die fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente zu analysieren. Wir haben negative Kontrollproben in die Analysen einbezogen, um eine mögliche Kontamination zu bewerten. Der genetische Analysator lieferte fluoreszierende Peaks spezifischer Farbe und Länge, die mit verschiedenen Bakterienarten korrelieren. Die digitalen Datendateien der ABI-Maschine wurden von der automatisierten Molecular Lab Cloud-Plattform (inBiome) analysiert, die Namen von Bakterienarten und deren Häufigkeit generiert. Wenn Bakterien nicht bis auf Artenebene identifiziert werden konnten, weil sie nicht in der MC-Referenzbibliothek vorhanden waren, klassifizierten wir Bakterien auf Stammebene oder aktualisierten in seltenen Fällen die MC-Referenzbibliothek, wenn wir durch 16S-Sequenzierungsergebnisse informiert wurden [8].

Wir haben die 16S-Region der isolierten ribosomalen DNA durch PCR verstärkt, die auf die V3-V4-Regionen abzielte, unter Verwendung eines einstufigen PCR-Protokolls. Wir haben die 16S-Amplikons auf der Illumina MiSeq-Plattform mit V3-Chemie und 2 × 251 Zyklen sequenziert. Wir haben die Vorwärts-Reads auf 240 Basen und die Reverse-Reads auf 210 Basen mit USEARCH gekürzt und Amplikonsequenzvarianten (ASV) mit UNOISE3 abgeleitet. Wir haben alle diese ASVs aufbewahrt, um Kontaminationsmuster sichtbar zu machen. Darüber hinaus führten wir Negativkontrollen aus den Molekularkulturanalysen durch, um eine Kontamination festzustellen. Wir haben die Taxonomie aller ASVs mithilfe des RDP-Klassifikators und der ribosomalen Datenbank SILVA 16S V132 (Auflösung auf Gattungsebene) bestimmt und zusätzlich die wichtigsten ASVs von Interesse manuell mit der NCBI-Datenbank verglichen, um sie zu überprüfen und die taxonomische Auflösung nach Möglichkeit zu erhöhen.

Wir haben alle Proben mit konventioneller Kultivierung, MC und 16S analysiert. Für die 16S-Analysen legen wir zunächst einen Schwellenwert von 5 % aller Lesevorgänge pro Probe als Untergrenze fest, um interessierende Signale zu identifizieren. Dieser anfängliche Schwellenwert wurde gewählt, da eine bakterielle Infektion in einer Probe, die normalerweise steril sein sollte, typischerweise zu einem robusten Signal führen sollte. Die Identifizierung echter 16S-Signale wurde darüber hinaus durch Kultur- und MC-Ergebnisse bestätigt und bestätigt, während die MC-Ergebnisse bei Bedarf durch Kultivierungs- und 16S-Sequenzierungsergebnisse neu interpretiert wurden. Abbildung 1 zeigt den reziproken Prozess des Vergleichs der Ergebnisse der verschiedenen Techniken, um zu einer endgültigen Identifizierung der Bakterienarten zu gelangen und die Übereinstimmung zu bewerten.

Reziproker Prozess der Analyse der Ergebnisse von Kultivierung, Molekularkultur (MC) und Illumina 16S-Sequenzierung (16S)

Bevor wir die Konkordanz bewerteten, verwendeten wir die Ergebnisse des Primärvergleichs, um Post-hoc-Analysen der Sequenzierungsdaten durchzuführen und die Gesamtergebnisse retrospektiv zu vergleichen. Wir nutzten diese Post-hoc-Analysen, um MC-Signale zu validieren, noch undefinierte MC-Ergebnisse zu interpretieren und die MC-Referenzbibliothek zu verfeinern, um mit der 16S-Sequenzierung eine bessere Unterscheidung zwischen kontaminierenden und echten Signalen zu ermöglichen und uns eine Meinung über die Gesamtergebnisse zu bilden. Wir nutzten die Post-hoc-Analysen auch zur Interpretation und Diskussion abweichender Befunde.

Wir haben die Konkordanz basierend auf dem Vorhandensein von Bakterienidentifikationen pro Technik und Teilnehmer bewertet. Wir zählten die Anzahl der Bakterienarten und ob sie in den Ergebnissen der Kultivierung, MC- und/oder 16S-Sequenzierung vorhanden waren, und bewerteten die Übereinstimmung zwischen den Techniken.

Wir haben die Ergebnisse von MC und 16S der Kultur steriler Knochen- und Ulkusbettproben untersucht, um einen Eindruck von ihrem zusätzlichen Wert für die klinische Verwendung zu bekommen.

Wir analysierten 20 Proben (11 Knochenbiopsien und 9 Ulkusbetten) von 18 Personen. In Tabelle 1 zeigen wir die Anzahl der Knochen- und Ulkusbettproben und ob diese Proben mit einer der Diagnosetechniken positive Ergebnisse lieferten. Wenn wir die Ergebnisse aller drei Diagnosetechniken zusammenfassen, identifizierten wir 84 Infektionserreger, die durch 29 verschiedene taxonomische Gruppen/Arten repräsentiert werden. Wir haben Bakterien nach ihrer Gramfärbung und ihren anaeroben Eigenschaften gruppiert. Die Anzahl der Proben, in denen jede Bakteriengruppe pro Technik identifiziert wurde, ist in Tabelle 2 aufgeführt.

Zunächst ignorierten wir 16S-Sequenzierungssignale unterhalb der 5 %-Schwelle. Ihr Vorhandensein wurde jedoch manchmal in den Kultivierungs- und/oder MC-Ergebnissen bestätigt. Beispielsweise wurden Streptococcus und Corynebacterium aurimucosum in einer Probe durch MC und durch Kultivierung nachgewiesen. Diese wurden auch mit 16S nachgewiesen, mit entsprechenden Signalen von 1,6 % Streptococcus und 3 % Corynebacterium aurimucosum. Ebenso wurde das Vorhandensein von Staphylococcus lugdunensis (0,5 %) und Streptococcus agalactiae (1,8 %) in einer anderen Probe durch 16S bestätigt. Im Gegenzug wurden einige MC-Analysen aktualisiert, indem entweder kleinere Peaks im Spektrum detaillierter untersucht wurden oder neue Stämme zur Referenzbibliothek hinzugefügt wurden, was durch mit 16S gefundene Ergebnisse bestätigt wurde. Rohdaten finden Sie im Abschnitt „Ergänzungsdaten“. 1 und 2 und im Datenrepositorium ENA mit der Projektnummer PRJEB56085 (16S). Einige große (> 5 %) Signale von Bakterien, die durch 16S in nachgewiesen wurden, konnten mit einem hohen Maß an Sicherheit verworfen werden, da es sich um ökologisch unplausible und bekannte Kontaminanten handelt [10] und/oder weil sie mit den beiden anderen Techniken nicht nachgewiesen wurden. Einige Bakterienarten von einigermaßen ökologischer Plausibilität wurden nur durch MC gefunden, z. B. Mycobacterium spp., Firmicutes spp., Lactobacillus salivarius und Haemophilus parainfluenzae, oder durch 16S-Sequenzierung, z. B. Enhydrobacter spp. Dabei handelt es sich um seltene Bakterienarten im DFO, die mit keiner der anderen Techniken bestätigt wurden und daher als abweichende Befunde eingestuft wurden. Wir konnten nicht feststellen, ob diese Signale echt waren.

Abbildung 2 zeigt die Anzahl der Bakterienarten pro Technik und die Übereinstimmung zwischen den drei Diagnosestrategien in einem Venn-Diagramm. Von den insgesamt 84 identifizierten Arten wurden 13 nur mit einer einzigen Technik identifiziert, die anderen Arten wurden mit zwei oder drei Techniken identifiziert. Es gab ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen MC- und 16S-Sequenzierung. Die Gesamtübereinstimmung zwischen MC und 16S betrug 80,5 %, wovon 54 % mit allen Techniken und weitere 26,5 % nur mit MC und 16S identifiziert wurden (Abb. 2). Die größte Diskrepanz bestand bei anaeroben Bakterien, die sowohl durch MC als auch durch 16S identifiziert wurden, jedoch nicht durch Kultivierung. Vier anaerobe Bacteriodales-Isolate (Bacteroides & Prevotella) wurden nur von MC und 16S gefunden (Tabelle 3).

Überblick über die Übereinstimmung diagnostischer Strategien beim Nachweis von Bakterienarten: Es wurden 84 Krankheitserreger, repräsentiert durch 29 verschiedene Bakterienarten, nachgewiesen. MC Molecular Culture, 16S Illumina 16S-Sequenzierung

Von den 11 Knochenproben wiesen 6 sterile Kulturen auf und bei Ulkusbettbiopsiekulturen waren es 2 von 9. Infektionserreger wurden in 4 der 6 sterilen Knochenkulturproben sowohl durch MC als auch durch 16S identifiziert (Tabelle 4).

Interessanterweise identifizierten wir in zwei der kulturnegativen Knochenproben, die laut MC und 16S positiv waren, denselben Infektionserreger (Serratia marcescens und Proteus mirabilis), als wir die zugehörigen Ulkusbettproben desselben Teilnehmers kultivierten. Es ist wichtig zu beachten, dass wir durch die Kultivierung in den Ulkusbettproben zusätzliche Bakterienarten identifiziert haben. Diese Ulkusbettproben wurden nicht mittels MC- oder 16S-Sequenzierung analysiert, da die Kulturergebnisse dieser Ulkusbettproben zu unverblindeten Proben in der BeBoP-Studie gehören. Nach Abschluss der BeBoP-Studie dürfen auch alle verblindeten Ulkusbettproben analysiert werden, sodass die Verschleierung der Randomisierung aufgehoben werden kann.

Von den 9 Ulkusbettproben wiesen 2 sterile Kulturen auf (Tabelle 4). Eine dieser Proben wies positive MC-Ergebnisse auf, die durch 16S-Sequenzierung nicht reproduziert werden konnten, nämlich ein Signal, das mit einem Mycobacterium spp. übereinstimmte. und ein Signal, das mit Pseudomonas aeruginosa übereinstimmt. Da durch Kultivierung und 16S-Sequenzierung im Allgemeinen Pseudomonas spp. Gut, das letztere Signal ist wahrscheinlich eine Verunreinigung oder das Ergebnis einer Probenverwechslung. Ebenso konnten wir nicht feststellen, ob das Mycobacterium spp. Es handelte sich um ein echtes Signal, da dieses Signal durch keine der anderen Techniken bestätigt wurde und das Vorkommen dieser Bakterienart in DFO in Nordwesteuropa bisher nicht beschrieben wurde.

In der anderen kultursterilen Ulkusbettprobe identifizierten wir einen Enhydrobacter aerosaccus, ein typisches Hautbakterium, mit 16S-Sequenzierung. Dieses Bakterium kommt in DFO ebenfalls selten vor und war wahrscheinlich auf eine Kontamination während des Vorbereitungsprozesses der 16S-Bibliothek zurückzuführen.

In dieser Studie verglichen wir die Kulturergebnisse mit den MC- und 16S-Sequenzierungsergebnissen von Knochen- und Ulkusbettbiopsien von Teilnehmern mit DFO der BeBoP-Studie. Wir fanden ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen MC- und 16S-Sequenzierungsergebnissen. Mit beiden molekularen Techniken konnten verschiedene Bakterien nachgewiesen werden, die durch Kultivierung in Proben mit geringer mikrobieller Biomasse nicht nachgewiesen werden konnten. Wichtig ist, dass darunter viele Anaerobier waren. Die doppelte Überprüfung von Bakteriensignalen, die mit herkömmlichen Kultivierungsmethoden nicht erfasst werden, unterstreicht die Notwendigkeit, schnelle molekulare Techniken wie MC für die routinemäßige Anwendung in einem klinischen Umfeld weiterzuentwickeln. Diese schnelle molekulare Technik sollte jedoch an größeren Probensätzen weiter validiert werden. Insbesondere muss die MC-Referenzbibliothek für die Analyse von Biopsien von Menschen mit DFO umfassender validiert werden. Größere Probensätze, einschließlich nicht infizierter Gewebekontrollen, würden auch dabei helfen, aufzuklären, ob es sich bei einigen der mit den abweichenden Befunden verbundenen Arten um echte Bakteriensignale handelt. Um den Mehrwert einer schnellen molekularen Technik wie MC voll auszuschöpfen, sollten auch die Behandlungsergebnisse von Menschen mit DFO berücksichtigt werden.

Der Vergleich klinischer Ergebnisse, bei denen die Behandlung entweder ausschließlich auf Kultivierungsergebnissen oder auf der MC-abgeleiteten mikrobiellen Identifizierung basiert, wird der eigentliche Lackmustest sein. Ein solcher Test garantiert, dass Antibiotika-Empfindlichkeitstests auch mit dieser molekularen Technik möglich sind. Eine umfassende genotypische Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung ist für die klinische Anwendung noch nicht machbar, aber die Entwicklungen auf diesem Gebiet sind rasant und es ist denkbar, dass dies auch in naher Zukunft möglich sein wird.

Die Einschränkungen der 16S-Sequenzierung sind allgemein bekannt [10]. Um die Kosten zu senken, werden 16S-Proben typischerweise im Multiplexverfahren sequenziert, während es für eine rechtzeitige klinische Anwendung wichtig ist, dass die Proben einzeln sequenziert werden können. Um (Reagenzien-)Kontaminanten und echte Signale in 16S-Daten in Proben mit geringer Biomasse zu identifizieren, ist es tatsächlich wichtig, mehrere Proben (einschließlich verschiedener negativer und positiver Kontrollen) zu Vergleichszwecken zusammenzufassen. Andererseits stellt die 16S-Sequenzierung ein relativ kostengünstiges und hervorragendes ergänzendes Werkzeug zur Analyse mehrerer Ergebnisse anderer (molekularer) Techniken dar, z. B. zu Validierungszwecken. Die 16S-Sequenzierung hat den Vorteil, dass umfangreiche öffentliche Referenzbibliotheken zur Verfügung stehen. Noch wichtiger ist jedoch, dass sie, wie bereits erwähnt, tatsächlich unabhängig von Referenzbibliotheken geworden ist, sodass sogar Mikroorganismen nachgewiesen werden können, die noch nie zuvor kultiviert wurden.

In unserer Studie haben wir einen wahrgenommenen Unterschied zwischen den Kultivierungsergebnissen von Knochen- und Ulkusbettbiopsien festgestellt. Dies ist von besonderem Interesse, da wir festgestellt haben, dass Knochenproben häufiger kulturnegativ waren als Proben aus Ulkusbetten und dass MC in Kombination mit 16S in der Mehrzahl dieser kultursterilen Knochenproben das Vorhandensein von Bakterienarten überzeugend nachweisen konnte. In kulturnegativen Ulkusbettbiopsien konnten MC und 16S keine überzeugenden bakteriellen Signale entdecken. Darüber hinaus wurden von MC und 16S in bestimmten kulturnegativen Knochenproben nachgewiesene Signale in einigen der entsprechenden Ulkusbettproben nachgewiesen. In diesen spezifischen Ulkusbettproben wurden jedoch auch zusätzliche Bakterien nachgewiesen, die von MC oder 16S in der entsprechenden Knochenprobe nicht nachgewiesen wurden. Dies deutet darauf hin, dass die mikrobielle Biomasse in Knochenproben noch geringer ist als in Ulkusproben und dass Knochenkulturen im Vergleich zu MC und 16S möglicherweise nicht alle vorhandenen Bakterien nachweisen. Diese Ergebnisse können auch darauf hindeuten, dass bei Biopsien des Ulkusbetts verschiedene Bakterien nachgewiesen werden, die nicht für die eigentliche Knocheninfektion verantwortlich sind. Anaerobe Kultivierungsmethoden, selbst für Ulkusbettproben, scheinen nicht empfindlich genug zu sein und erfordern möglicherweise zusätzliche Tests. Das Problem des fehlenden Bakteriennachweises in Proben mit geringer mikrobieller Biomasse und das Problem des fehlenden Nachweises anaerober Bakterien können mit einem DFO-validierten MC-Ansatz gelöst werden. Wie bereits erwähnt, besteht auch bei einem validierten MC-Ansatz derzeit weiterhin die Notwendigkeit einer Kultivierung, um Antibiotikaresistenzprofile und Antibiotikaempfindlichkeitstests von Bakterien zu bestimmen. Die Kombination aus der Kultivierung von Ulkusbettbiopsien und der Durchführung von MC an Knochenproben könnte den schnellsten Beginn einer geführten Antibiotikatherapie bei DFO ermöglichen. MC kann vorhandene Bakterienarten schnell identifizieren, während durch Kultivierung gewonnene Resistenzprofile zur möglichen Anpassung dieser Therapie genutzt werden können.

Bei der BeBoP-Studie handelt es sich um eine laufende Studie (Folgephase bis Ende 2023), daher haben wir diese Untersuchung an einer relativ kleinen Anzahl von Proben durchgeführt. Wir nutzten diese Pilotstudie, um Ergebnisse zu untersuchen, unsere Sequenzierungsprotokolle zu verfeinern und die MC-Referenzbibliothek für Knochen- und Ulkusbettbiopsien zu verbessern. In einer Folgestudie werden wir alle Stichproben der BeBoP-Studie analysieren. Die Proben werden dann nicht mehr verblindet und wir haben Zugang zu allen Kulturinformationen zu Knochenbiopsien, passenden Ulkusbettbiopsien und Informationen zum Teilnehmerergebnis, was es uns möglicherweise ermöglicht, unerwünschte DFO-Ergebnisse als Ergebnis bisher unentdeckter verursachender Bakterien zu erklären.

Wir fanden ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen der relativ neuen und schnellen molekularen Technik der MC und der etablierten Technik der Illumina 16S (16S)-rRNA-Sequenzierung in Knochen- und Ulkusbettbiopsieproben mit geringer mikrobieller Biomasse bei Menschen mit DFO. Diese molekularen Techniken konnten auch verschiedene Bakterien, darunter viele Anaerobier, nachweisen, die durch herkömmliche Kultivierung in diesen Knochen- und Geschwürbettproben nicht nachgewiesen werden konnten. Der zusätzliche Wert molekularer Techniken eröffnet Perspektiven für den routinemäßigen Einsatz schneller molekularer Techniken wie MC bei der Diagnose von diabetischer Fußosteomyelitis und anderen Infektionen.

Alle Ergebnisdaten sind in den Zusatzdaten Nr. 1 aufgeführt. Zusätzliche anonymisierte Daten zu Teilnehmern der BeBoP-Studie können auf begründete Anfrage von den Autoren (MCTT Gramberg/EJG Peters) angefordert werden, und die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Sequenzierungsdaten sind verfügbar im ENA-Repository (Weblink: ENA Browser (ebi.ac.uk)), Zugangsnummer zum Datensatz: PRJEB56085.

Illumina 16S rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung

Angewandte Biosysteme

Amplikon-Sequenzvarianten

BonE BioPsy-Studie

Gehirn-Herz-Infusion

Schafsblut

Desoxyribonukleinsäure

Diabetische Fußosteomyelitis

Europäisches Komitee für Antibiotika-Empfindlichkeitstests

Inter-Space-Region

Molekulare Kultur

Multiplex-Polymerase-Kettenreaktionen

Schokoladenagar

Ribosomale Ribonukleinsäure

Ulkusbettbiopsie

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken allen Kollegen, die jeden Tag in unserem Amsterdamer UMC-Zentrum für diabetische Fußkomplikationen (ACDC) arbeiten, um die beste Patientenversorgung zu gewährleisten.

Diese Arbeit wurde von der Dutch Diabetes Research Foundation mit der Fördernummer 2017.82.014 unterstützt.

Abteilung für Innere Medizin, Abteilung für Infektionskrankheiten, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, De Boelelaan 1117, Amsterdam, Niederlande

Meryl Cinzía Tila Tamara Gramberg, Carmen Knippers und Edgar Josephus Gerardus Peters

Abteilung für Rehabilitationsmedizin, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, De Boelelaan 1117, Amsterdam, Niederlande

Meryl Cinzía Tila Tamara Gramberg, Rimke Sabine Lagrand, Vincent de Groot und Louise Willy Elizabeth Sabelis

Amsterdamer Bewegungswissenschaften, Rehabilitation und Entwicklung, Amsterdam, Niederlande

Meryl Cinzía Tila Tamara Gramberg, Rimke Sabine Lagrand, Vincent de Groot, Louise Willy Elizabeth Sabelis und Edgar Josephus Gerardus Peters

Amsterdam Infection & Immunity, Infektionskrankheiten, Amsterdam, Niederlande

Meryl Cinzía Tila Tamara Gramberg & Edgar Josephus Gerardus Peters

Amsterdam UMC Zentrum für diabetische Fußkomplikationen (ACDC), Amsterdam, Niederlande

Meryl Cinzía Tila Tamara Gramberg, Rimke Sabine Lagrand, Max Nieuwdorp, Vincent de Groot, Louise Willy Elizabeth Sabelis und Edgar Josephus Gerardus Peters

Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Infektionsprävention, Amsterdam UMC, Amsterdam Medisch Centrum, Meibergdreef 9, Amsterdam, Niederlande

Jarne Marijn van Hattem & Sebastien Matamoros

Abteilung für experimentelle Gefäßmedizin, Amsterdam UMC, Amsterdam Medical Center, Meibergdreef 9, Amsterdam, Niederlande

Marcus Christofoor de Goffau, Mark Davids und Max Nieuwdorp

Amsterdam UMC, Amsterdam Medical Center, Tytgat Institut für Leber- und Darmforschung, Amsterdam, Niederlande

Marcus Christofoor de Goffau

Sanger Institute, Cambridge, Großbritannien

Marcus Christofoor de Goffau

Inbiome, Amsterdam, Niederlande

Andries Edward Budding Budding

Abteilung für Innere Medizin, Abteilung für Endokrinologie, Amsterdam UMC, Vrije Universiteit Amsterdam, Academic Medical Center, De Boelelaan 1117, Amsterdam, Niederlande

Martin den Heijer

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Die in diesem Manuskript aufgeführten Autoren haben alle dazu beigetragen, dieses Manuskript zu verfassen, zu überprüfen und seinen intellektuellen Inhalt zu verfeinern. MCTT Gramberg ist Ärztin in Ausbildung zum Facharzt (Innere Medizin), Doktorandin und Epidemiologin in Ausbildung, koordinierende Forscherin der BeBoP-Studie, zusammen mit CK koordinierte sie diese Studie und leitete das Verfassen dieses Manuskripts. C Knippers ist Medizinstudentin und hat zusammen mit MCTT diese Studie koordiniert und durchgeführt. RS Lagrand ist Doktorandin, koordinierende Forscherin der BeBoP-Studie und Rehabilitationsspezialistin. JM van Hattem ist medizinische Mikrobiologin, die an der BeBoP-Studie arbeitet, und er hat die Analysen koordiniert und durchgeführt MC de Goffau ist insbesondere hinsichtlich der Kulturen des BeBoP-Versuchs und der vorliegenden Studie ein Spezialist für die Sequenzierungsforschung mit geringer mikrobieller Biomasse. Er analysierte die 16S-, IS-Pro- und Kultivierungsdaten, um zwischen echten Signalen und (Sequenzierungs-)Kontaminanten zu unterscheiden. AE Budding ist klinischer Mikrobiologe und entwickelte die Molekularkulturtechnik. In dieser Studie führte er alle Analysen der MC-Daten durch, M Davids ist Bioinformatiker am Microbiota Centre Amsterdam, S. Matamoros ist Postdoktorandin für molekulare Mikrobiologie, M. Nieuwdorp ist Internist, Endokrinologe und Spezialist für Gefäßmedizin, V de Groot ist Rehabilitationsspezialist und Epidemiologe, M. den Heijer ist Internist, Endokrinologe und Epidemiologe, LWE Sabelis ist Als Rehabilitationsspezialist und Forscher in der BeBoP-Studie ist EJG Peters der Hauptforscher der BeBoP-Studie und der aktuellen Studie, Internist, Spezialist für Infektionskrankheiten und Spezialist für Akutmedizin. Alle haben mit ihrem Fachwissen beigetragen.

Korrespondenz mit Meryl Cinzía Tila Tamara Gramberg oder Edgar Josephus Gerardus Peters.

Die BeBoP-Studie (einschließlich der vorliegenden Studie) wurde am 12. Februar 2019 von einer unabhängigen Ethikkommission des Sponsors, dem Standort VUmc des Amsterdam University Medical Centers (Referenznummer 2018.394), genehmigt. Alle Teilnehmer der BeBoP-Studie gaben ihre Einverständniserklärung für die Randomisierung Prozess und zusätzliche Zustimmung zur Verwendung ihrer Körpermaterialien für die vorliegende Studie. Alle im BeBoP-Versuch und in der vorliegenden Studie durchgeführten Methoden entsprachen den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften sowie der Deklaration von Helsinki.

Unzutreffend.

Alle Autoren geben an, dass bei ihnen kein Interessenkonflikt besteht, mit Ausnahme von Dr. AE Budding (Inhaber von InBiome).

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Wir fanden ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen Molekularkultur und 16S-Sequenzierung und diese Techniken waren auch in der Lage, Bakterien zu erkennen, die durch Kultivierung nicht nachgewiesen wurden. Dies eröffnet Perspektiven für den routinemäßigen Einsatz schneller molekularer Techniken bei der Diagnose diabetischer Fußosteomyelitis und anderer infizierter Gewebeproben.

Zusatzdatei 1: Ergänzende Daten 1.

Zusatzdatei 2: Ergänzende Daten 2.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Gramberg, MCTT, Knippers, C., Lagrand, RS et al. Übereinstimmung zwischen Kultur, Molekularkultur und Illumina 16S rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung von Knochen- und Ulkusbettbiopsien bei Menschen mit diabetischer Fußosteomyelitis. BMC Infect Dis 23, 505 (2023). https://doi.org/10.1186/s12879-023-08472-w

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Eingegangen: 11. August 2022

Angenommen: 19. Juli 2023

Veröffentlicht: 01. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12879-023-08472-w

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