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Aug 17, 2023

Transkriptionsvariation bei Babesia gibsoni (Wuhan-Isolat) zwischen In-vivo- und In-vitro-Kulturen im Blutstadium

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 268 (2023) Diesen Artikel zitieren 1 Details zu Altmetric Metrics Babesia gibsoni, der Erreger der Babesiose bei Hunden, gehört zum Stamm Apicomplexa.

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 268 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Babesia gibsoni, der Erreger der Babesiose bei Hunden, gehört zum Stamm Apicomplexa. Die Entwicklung der In-vitro-Kulturtechnologie hat den Forschungsfortschritt in verschiedenen Arten von Omics-Studien vorangetrieben, einschließlich der transkriptomischen Analyse von Plasmodium spp. zwischen In-vitro- und In-vivo-Umgebungen, was zur Beobachtung diagnostischer Antigene und zur Entwicklung von Impfstoffen geführt hat. Dennoch liegen keine Informationen zu Babesia spp. vor. Diesbezüglich konnten Erkenntnisse gewonnen werden, die das weitere Verständnis des Wachstums und der Entwicklung von Parasiten im Blutstadium erheblich erschweren.

In dieser Studie wurden erhebliche Veränderungen in der Morphologie und Infektiosität von kontinuierlich in vitro kultivierten B. gibsoni (Wuhan-Isolat) im Vergleich zu in vivo-Parasiten beobachtet. Basierend auf diesen Veränderungen wurde B. gibsoni (Wuhan-Isolat) sowohl aus In-vivo- als auch in-vitro-Kulturen gesammelt, gefolgt von einer vollständigen RNA-Extraktion und einer Illumina-Transkriptomsequenzierung. Die erworbenen differentiell exprimierten Gene (DEGs) wurden mithilfe von qRT-PCR validiert und anschließend über mehrere Datenbanken funktionell annotiert. Das Gen mit der stärksten Hochregulierung nach der In-vitro-Kultur wurde aus dem Genom von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) kloniert und durch Western Blot und indirekten Immunfluoreszenztest zum Nachweis der nativen Form und der zellulären Lokalisierung charakterisiert.

Durch die Laborkultivierung wurden mehrere Formen von Parasiten beobachtet, und es wurde festgestellt, dass die Infektiosität von in vitro kultivierten Parasiten bei Hunden geringer war. Basierend auf diesen Änderungen wurde eine Illumina-Transkriptomsequenzierung durchgeführt, die zeigte, dass 377 Unigene hochreguliert und 334 Unigene herunterreguliert wurden. Insbesondere wurde eine AP2-Transkriptionsfaktorfamilie, die für alle Entwicklungsstadien von Parasiten essentiell ist, gescreent und die Transkriptionsveränderungen bei diesen Familienmitgliedern getestet. Daher wurde das neue AP2-Transkriptionsfaktor-Gen (BgAP2-M) mit der höchsten hochregulierten Expression nach In-vitro-Anpassung ausgewählt. Dieses Gen umfasst einen offenen Leserahmen (ORF) von 1989 Basenpaaren, der ein Protein voller Länge aus 662 Aminosäuren kodiert. BgAP2-M enthält eine AP2-Domäne und eine ACDC-konservierte Domäne, die möglicherweise an der Kernbiologie von Parasiten beteiligt sind. Die hergestellten polyklonalen Antikörper gegen die BgAP2-M-Peptide wiesen außerdem eine native Größe von ~ 73 kDa auf und waren in den Kernen von B. gibsoni lokalisiert.

Diese Studie präsentiert erstmals eine gründliche Transkriptomanalyse von B. gibsoni in vivo und in vitro und trägt zu einem detaillierten Verständnis der Auswirkungen von Umweltveränderungen auf das Wachstum und die Entwicklung von Parasiten im Blutstadium bei. Darüber hinaus bietet es auch eine tiefergehende Untersuchung der verschiedenen Mitglieder der ApiAP2-Transkriptionsfaktorfamilie als verschiedene Regulatoren des Lebensstadiums bei Babesia spp.

Babesia-Arten sind obligate intraerythrozytäre Hämoprotozoen, die taxonomisch in den Stamm Apicomplexa, die Klasse Piroplasmea, die Ordnung Piroplasmida und die Familie Babasidae eingeteilt werden [1,2,3]. Babesia gibsoni ist ein Hämoprotozoen-Parasit, der typische Babesiose-Symptome bei Hunden wie hämolytische Anämie, Hämoglobinurie, blutdrucksenkenden Schock und Tod verursacht [4,5,6]. Dieser Organismus wird auch transovarial durch Haemaphysalis longicornis übertragen, der in hügeliger Wildnis weit verbreitet ist [7,8,9,10].

Für verschiedene Apicomplexan-Parasiten, darunter Babesia bovis, B. bigemina, B. gibsoni, B. orientalis, Plasmodium falciparum und P. knowlesi, wurden Labor-In-vitro-Kultursysteme eingerichtet [11,12,13,14,15]. Aufgrund mehrerer In-vitro-Umweltfaktoren, einschließlich physikalischer, ernährungsbedingter und immunologischer Faktoren, die sich von denen in vivo unterscheiden, neigen Parasiten dazu, sichtbare und bedeutsame Veränderungen in der Morphologie, Infektiosität und Virulenz zu zeigen. Beispielsweise führte die langfristige In-vitro-Kultivierung im B. gibsoni Oita-Isolat zu größeren und vielgestaltigen Parasiten in den Erythrozyten des Wirts und zu einer geringeren Parasiteninfektiosität bei Hunden [13, 16]. Daher wird angenommen, dass die tieferen Transkriptionsänderungen provozierend und bedeutsam sind. Allerdings wurden solche Veränderungen in Genen, die durch In-vitro-Kultur beeinflusst werden, sowohl bei P. falciparum als auch bei P. knowlesi untersucht [17, 18, 19, 20]. Solche Veränderungen bedeuten gelegentlich eine Anpassung der Parasiten an die Umgebung, was zu einem besseren Überleben und einer besseren Vermehrung führt [21]. Beispielsweise wurden einige Gene im sexuellen Stadium (Gametenantigen 27/25) und andere, die mit der Invasion und dem Wachstum im asexuellen Stadium zusammenhängen (MSP7, DOC2 und CLAMP), mit relativ großen Transkriptionsvariationen identifiziert, da die Wahrscheinlichkeit ihrer Übertragung weitaus geringer ist zu neuen Mückenvektoren und dringen in In-vitro-Umgebungen eher in Erythrozyten des Wirts ein [17, 19]. Bemerkenswerterweise erfuhren auch verschiedene ApiAP2-Transkriptionsfaktoren einen gewissen Grad an Transkriptionsveränderungen. Es wurde festgestellt, dass diese Proteinfamilie mit ein bis drei DNA-Bindungsdomänen die größte Transkriptionsfaktorfamilie in apikomplexen Organismen ist und alle Entwicklungsstadien von Parasiten präzise reguliert (22, 23). In P. falciparum wurde gut dokumentiert, dass zwei AP2-Transkriptionsfaktoren, PF3D7_1222600 (PfAP2-G) und PF3D7_1222400 (PfAP2-G4), Funktionsverlust-Nonsense-Mutationen mit vorzeitigen Stoppcodons aufweisen, was zu einer enormen Unterdrückung der Gentranskription während der Gametozytogenese führt . Ein weiterer AP2-Transkriptionsfaktor (PF3D7_1342900, PfAP2-HS) wurde mit drei Nonsense-Mutationen nachgewiesen, die sich alle stromaufwärts der vorhergesagten AP2-Domänen befanden und das Protein voller Länge verkürzten. Diese transkriptionsbeeinflussten Mutationen in PfAP2-HS resultierten wahrscheinlich aus einer verbesserten Toleranz gegenüber Temperaturschwankungen in In-vitro-Umgebungen [18]. Darüber hinaus wurden in neueren Studien erhöhte Transkriptmengen eines AP2-Gens unbekannter Funktion (PF3D7_0420300) beobachtet, das möglicherweise an der asexuellen Fortpflanzung beteiligt ist [19].

Seit der Etablierung der In-vitro-Kultur bei Apicomplexan-Arten vor mehreren Jahrzehnten hat sich das Verständnis der Parasitenbiologie erheblich verbessert, und es wurden einige Durchbrüche bei der Impfstoffentwicklung und der Identifizierung von Arzneimittelzielen erzielt. Bei Plasmodium spp. wurden transkriptomische Studien an Parasiten aus In-vitro- und In-vivo-Umgebungen durchgeführt und dabei bedeutsame DEGs identifiziert, die mehrere biologische Prozesse beeinflussen können. Über Babesia spp. liegen jedoch nur wenige Informationen vor. Hier führten wir zunächst eine Transkriptomsequenzierung von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) in vivo und in vitro-Kulturen im Blutstadium durch, basierend auf Veränderungen in der Parasitenmorphologie, Infektiosität und Virulenz. Somit wurden Gene mit signifikant unterschiedlicher Expression auf Transkriptebene identifiziert.

Darüber hinaus wurde die ApiAP2-Transkriptionsfaktorfamilie durch quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) analysiert, was zur Beobachtung eines neuen AP2-Gens (BgAP2-M) mit der stärksten Hochregulierung nach In-vitro-Kultur führte. Die Expression und Lokalisierung von BgAP2-M wurde mittels Western Blot und indirektem Immunfluoreszenzassay (IFA) untersucht und zeigte seine wichtige Rolle im Blutstadium. Insgesamt liefert unsere Forschung umfassende Einblicke in die Transkriptionsvariation bei B. gibsoni (Wuhan-Isolat) beim Übergang von In-vivo- zu In-vitro-Umgebungen und wird beim Screening von Kandidatenantigenen für zukünftige diagnostische Verwendung eine große Hilfe sein.

Vier weibliche Beagles (1 Jahr alt) wurden vom Anlu Laboratory Animal Center gekauft und durch mikroskopische Untersuchung von Giemsa-gefärbten Blutausstrichen und PCR als frei von natürlichen Babesien bestätigt. Den Tieren wurden täglich Standardmengen an Futter und Trinkwasser zur Verfügung gestellt. Als Erythrozyten- und Serumspender dienten zwei Beagles. Nach der Splenektomie wurden zwei weitere experimentelle Beagles in vivo und in vitro mit 2 × 108 Erythrozyten geimpft, die mit B. gibsoni (Wuhan-Isolat) infiziert waren. Die Rektaltemperatur wurde täglich aufgezeichnet und täglich wurden Blutproben entnommen, um die Parasitämie zu überwachen. Sobald der Wert 20 % überstieg, wurden venöse Blutproben zur weiteren Analyse entnommen.

Gemäß zuvor im Labor erstellten Protokollen (unveröffentlicht) handelte es sich bei dem Kulturmedium um RPMI 1640 (Gibco), das 0,9 mM Natriumpyruvat, 24 mM NaHCO3 mit einem pH-Wert von 6,9, Penicillin G mit 200 Einheiten/ml und Streptomycin mit 200 μg/ml enthielt und einschließlich 20 % Hundeserum für die In-vitro-Kultur. Normale Hundeerythrozyten wurden mit dem Antikoagulans EDTA-K2 von Spenderhunden versorgt. Das Vollblut wurde dreimal mit Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium durch 10-minütige Zentrifugation bei 500 × g und 4 °C gewaschen und die Leukozytenschicht entfernt. Die gewaschenen Hundeerythrozyten wurden zu einem doppelten Volumen RPMI 1640-Medium gegeben und zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert. Normales Hundeserum wurde von Spenderhunden gesammelt und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. In einer Plastikkulturplatte mit 24 Vertiefungen wurden 100 μl Erythrozyten in 900 μl Kulturmedium suspendiert, um ein endgültiges gepacktes Zellvolumen (PCV) von 10 % zu erreichen. Alle 24 Stunden wurden etwa 800 μl Kulturüberstand ohne Störung der sedimentierten Erythrozyten entnommen und durch Auffrischungsmedium ersetzt. Zur Überwachung der Parasitämie wurde täglich eine mikroskopische Untersuchung der sedimentierten Erythrozyten durchgeführt. Alle drei bis vier Tage wurden Subkulturen hergestellt. Als die Parasitämie 8 % erreichte, wurde eine 100-μl-Kulturmediummischung, die etwa 8 × 106 infizierte Erythrozyten enthielt, in eine neue Vertiefung mit einer Suspension aus 800 μl frischem Kulturmedium und 100 μl normalen Hundeerythrozyten überführt. Die Parasiten wurden im Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C kultiviert. Babesia gibsoni (das Wuhan-Isolat) wurde über 150 Passagen stabil kultiviert.

Es wurden sedimentierte, mit B. gibsoni (Wuhan-Isolat) infizierte Erythrozyten in vivo (P0) und in vitro (P150, 150 Generationen) gesammelt. Kurz gesagt, die Blutproben wurden 10 Minuten lang bei 500 × g und 4 ° C zentrifugiert. Anschließend wurde den gesammelten Erythrozyten ein 10-faches Volumen an Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC) (Biosharp, Hefei, China) zugesetzt und anschließend 15 Minuten bei 4 ° C inkubiert. Die Lysate wurden durch eine 3-μm-Membran (Whatman, Florham Park, NJ, USA) filtriert und 15 Minuten lang bei 4 ° C und 10.000 × g zentrifugiert, um die angereicherten Parasitenpellets zu erhalten.

Die gesammelten Parasitenpellets wurden in 1 ml TRIzol®-Reagenz (TransGen Biotech, Peking, China) resuspendiert und bis zur Verwendung bei –80 ° C gelagert. Um RNA zu extrahieren, wurden 200 μl Chloroform pro ml TRIzol zu den Probenüberständen gegeben, gefolgt von einem 30-sekündigen Vortex und einer 5-minütigen Inkubation bei 4 °C. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 10.000 × g und 4 °C zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Mikrofugenröhrchen mit einem gleichen Volumen Isopropylalkohol überführt, gefolgt von einer statischen Inkubation für 10 Minuten. Zur Isolierung der Gesamt-RNA wurden die Proben 15 Minuten lang bei 10.000 × g und 4 °C zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die angereicherten RNA-Pellets wurden mit 1 ml 75 %igem Ethanol gemischt und 15 Minuten lang bei 10.000 × g und 4 °C zentrifugiert. Nachdem die RNA-Pellets in 30 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser gelöst wurden, wurde die Qualitätskontrolle mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) und einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) durchgeführt.

Der Aufbau der RNA-Sequenzierungsbibliothek (RNA-Seq) wurde mit Novogene durchgeführt. Poly(A)+-RNA (Messenger-RNA [mRNA]) wurde unter Verwendung von Magnetkügelchen mit Oligo (DT) angereichert und unter Verwendung eines Fragmentierungspuffers fragmentiert. Nach der Synthese einzelsträngiger komplementärer DNA (cDNA) mit zufälligen Hexameren wurden Puffer, dNTPs, DNA-Polymerase I und RNase H verwendet, um doppelsträngige (ds) cDNA zu synthetisieren. Die erworbene ds-cDNA wurde mit AMPure XP-Kügelchen (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) gereinigt, anschließend endrepariert, 3'-Enden adenyliert und mit einem Barcode-Adapter an das Ende ligiert. Die Fragmente wurden durch PCR angereichert, um die endgültigen Bibliotheken zu erhalten, gefolgt von einer primären Quantifizierung mit dem Qubit® 2.0 dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). Die verdünnten Bibliotheken wurden mithilfe von qRT-PCR genau untersucht und mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) nach Größe sortiert. Die gemultiplexten RNA-Seq-Bibliotheken wurden mithilfe von Paired-End-Reads mit 150 Basenpaaren (bp) auf einer NovaSeq 6000-Plattform (Illumina) sequenziert.

Saubere Daten im FASTQ-Format wurden durch Entfernen von Lesevorgängen, die einen Adapter, Poly-N und Lesevorgänge mit geringer Qualität (< Q20) enthielten, mit Cutadapt (Version 1.15) erhalten. Anschließend wurden die effektive Rate, die Fehlerrate, Q20, Q30 und der Guanin-Cytosin (GC)-Gehalt der sauberen Daten berechnet und validiert. Hochwertige saubere Lesevorgänge wurden mit Trinity (Version 2.12.0) [24] mit K-mer = 25 bp zusammengestellt, um die zusammengestellten Transkripte und Unigene zu erhalten. Die Parameter des B. gibsoni-Genoms (unveröffentlicht) wurden in der Trinity-Software festgelegt, um sauberere Unigene-Sequenzen ohne Wirtstranskripte zu erhalten. Die Annotation der Genfunktionen basierte auf mehreren öffentlichen Online-Datenbanken, darunter nicht-redundante Proteinsequenzen (NR) des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Gene Ontology (GO) und eggNOG (evolutionäre Genealogie). von Genen: Non-supervised Orthologous Groups), Swiss-Prot und Pfam-Datenbanken.

Die zusammengestellten Unigene-Sequenzen wurden mit sauberen Lesevorgängen unter Verwendung der RSEM-Software (Recursive Structural Equation Model) (Standardparameter) [25] kartiert, um die Gen- und Isoform-Expressionsniveaus abzuschätzen. DEGs wurden mit der DESeq2-Software (Version 1.32.0) analysiert. Die Kriterien P-bereinigter Wert < 0,05 [26] und |log2FoldChange|> 1 wurden festgelegt, um signifikante DEGs zu überprüfen. Die TransDecoder-Software (Version 5.5.0) wurde verwendet, um die Kandidaten-Kodierungsregionen innerhalb der Transkriptsequenzen zu identifizieren. EggNOG-Mapper v2 (http://eggnog-mapper.embl.de/) wurde online für die funktionale Annotation und Domänenvorhersage von Kandidaten-Open-Reading-Frames (ORF) verwendet, einschließlich GO-Term-Annotation und KEGG-Signalweganreicherung.

Mehrere Gene wurden zufällig ausgewählt, um die Genauigkeit der analysierten Transkriptomdaten mittels qRT-PCR zu bestätigen. Die RNA wurde mit der gleichen Methode wie zuvor beschrieben isoliert. TURBO DNase (Thermo Fisher Scientific, USA) wurde verwendet, um in den extrahierten RNA-Proben verbleibende DNA-Kontaminationen gründlich zu entfernen. Die Konzentrations- und Absorptionsverhältnisse für 260/280 nm und 260/230 nm Nachbehandlungs-RNA wurden mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Eine Menge von 400–500 ng Gesamt-RNA aus jedem Parasitenpräparat wurde unter Verwendung eines PrimeScript RT-Reagenzienkits mit gDNA-Eraser (Genom-DNA) (TaKaRa Bio) revers in cDNA transkribiert. qRT-PCR wurde unter Verwendung des ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, China) auf einem QuantStudio®5 qRT-PCR-System (Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Spezifische Primer wurden mit der Clone Manager-Software entworfen. Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) war das Referenzgen zur Normalisierung der Zielgenexpression. Die 2−ΔΔCt-Methode wurde zur Berechnung des relativen Expressionsniveaus von Unigenen verwendet [27].

Das BgAP2-M-Gen wurde mithilfe spezifischer Primer aus genomischer DNA und cDNA amplifiziert. Die Aminosäuresequenz (aa) von BgAP2-M wurde mit dem ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder) übersetzt. Das Simple Modular Architecture Research Tool (SMART) wurde verwendet, um die konservierten Domänen in der BgAP2-M-aa-Sequenz vorherzusagen [28]. Das Kernlokalisierungssignal (NLS) wurde mit NLStradamus vorhergesagt [29]. Mit ClustalW wurden mehrere Proteinsequenz-Alignments durchgeführt [30]. Die MEGA7-Software wurde für die phylogenetische Analyse von BgAP2-M unter Homologen in anderen Apicomplexan-Arten verwendet, nämlich B. bovis, B. bigemina, B. divergens, B. ovata, B. microti, Theileria annulata, P. falciparum, P. yoelii und P. berghei [31]. SWISS-MODEL wurde zur Modellierung der Tertiärstrukturhomologie der AP2-Domäne von BgAP2-M verwendet [32].

Peptide im Bereich von 12 bis 15 aa wurden basierend auf der Proteinsequenz von BgAP2-M wie folgt synthetisiert: MPDKRQRRSSRKKLS (288–302 aa) und KQYTSNLTDEQKSHR (531–545 aa). Zwei weiße Neuseeland-Kaninchen wurden mit an Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin (KLH) konjugierten Peptiden immunisiert, gefolgt von sechs Auffrischungsimpfungen in Abständen von zwei Wochen. Die Immunserumtiter wurden durch einen Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) bestimmt und die Kaninchen wurden 10 Tage nach der letzten Impfung entblutet. Gereinigte polyklonale Antikörper wurden für das anschließende Immunblotting und die IFA verwendet.

Das Saponin-lysierte Gesamtparasitenprotein für den Immunblot wurde aus B. gibsoni-In-vivo- und In-vitro-Blutproben hergestellt, dann durch 12,5 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen übertragen . Die Membranen wurden mit 5 % (w/v) Magermilch in Tris-gepufferter Salzlösung Tween 20 (TBST) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur blockiert und dann bei 4 Stunden mit primären Antikörpern gegen BgAP2-M und Histon H3 (Proteintech, USA) sondiert °C über Nacht. Nach drei Wäschen in TBST wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert und unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenzreagenzien (Advansta, USA) nachgewiesen.

IFAs wurden durchgeführt, um die Lokalisierung von BgAP2-M nachzuweisen. Die in vitro kultivierten B. gibsoni-Abstriche wurden luftgetrocknet und mit kaltem 95 % Methanol und 5 % Aceton (v/v) bei –20 °C 20 Minuten lang fixiert. Vorbereitete Proben wurden mit 0,05 % Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 10 Minuten lang permeabilisiert und dann dreimal mit PBS gewaschen. Die Objektträger wurden mit primären Antikörpern gegen BgAP2-M und GAPDH (Proteintech, USA), 1:1000 verdünnt in 3 % Rinderserumalbumin (BSA)/PBS, bei 4 °C über Nacht inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit den sekundären Antikörpern Alexa Fluor 594- Konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G (IgG) und Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific, USA), 1:1000 verdünnt in 3 % BSA/PBS bei 37 °C für 1 Stunde. Die Kernfärbung der Parasiten wurde mit Hoechst 33342 bei Raumtemperatur für 10 Minuten durchgeführt. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen.

Babesia gibsoni wurde erfolgreich in vitro in 20 % Serum kultiviert. Nach der Teilung erreichte die Parasitämie am dritten Tag 10 % ± 1,5 % (Abb. 1A).

Veränderungen der Parasitämie und Morphologie von in vitro kultivierten B. gibsoni (Wuhan-Isolat). A Veränderungen der Parasitämie von in vitro kultivierten B. gibsoni (Wuhan-Isolat) innerhalb von 3 Tagen nach der Aufteilung. B Morphologische Veränderungen in B. gibsoni (Wuhan-Isolat) nach In-vitro-Anpassung. (1–3) Die kleinen punktförmigen, fadenförmigen und dyadischen Parasiten der In-vivo-Umgebung. (4–7) Frühe Ringe, reife Ringe, filamentöse und multiple Parasiten der In-vitro-Umgebung. (8–13) Junge Dyade, reife Dyade, junge Tetraden, reife Tetraden, junge oktoploide, reife oktoploide Parasiten der In-vitro-Umgebung. (14, 15) Schizonten und Merozoiten, die aus Erythrozyten austreten. Stäbe, 5 μm. C Der Anteil verschiedener Formen von Parasiten aus In-vivo- und In-vitro-Umgebungen, die 10 % mit B. gibsoni infizierte Erythrozyten enthalten. Die statistische Analyse: ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns: nicht signifikant (mehrere Student-t-Tests). Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) für drei biologische Replikate dar

Morphologische Beobachtungen von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) im Wirbeltierwirt zeigten bei der mikroskopischen Untersuchung von Giemsa-gefärbten Zellen kleine Ring- und Punktformen (Abb. 1B). Die kleinen ringförmigen Parasiten hatten eine mittlere Größe von 1,75 ± 0,26 μm × 1,85 ± 0,30 μm. Es wurden weder extrazelluläre noch multiple Formen von Parasiten wie Tetraden oder Oktoploiden beobachtet [13]. Nach kontinuierlicher In-vitro-Kultivierung wurden jedoch verschiedene Formen von Parasiten beobachtet, darunter größere ringförmige Parasiten, filamentöse Parasiten, dyadenförmige Parasiten, tetradenförmige Parasiten, sogar oktoploide Parasiten und Schizonten (Abb. 1B). Als die Parasitämie signifikant zunahm, wurden viele austretende Merozoiten außerhalb der Erythrozyten des Wirts beobachtet, und in einem Erythrozyten wuchsen zwei verschiedene Formen von Parasiten. Am 3. Tag der 150. Generation hatten mit einer Parasitämie von 10 % die mit den ringförmigen Parasiten parasitierten Erythrozyten den größten Anteil aller infizierten Erythrozyten. Im Gegensatz dazu hatten oktoploide und schizontenparasitierte Erythrozyten die niedrigsten Anteile (Abb. 1C).

Die Infektiosität der Hunde wurde durch intravenöse Inokulation von 2 × 108 infizierten Erythrozyten aus in vivo-Blutproben oder in vitro-Kulturen untersucht. Veränderungen der Parasitämie und der Temperatur im Laufe der Zeit nach der Inokulation sind in Abb. 2 dargestellt. Die Parasitämie eines mit B. gibsoni (Wuhan-Isolat) in vivo-Parasiten infizierten Hundes stieg in den ersten 10 Tagen langsam auf 3 % an. Gleichzeitig schwankte die Körpertemperatur nicht stark und blieb im Bereich von 38,5–39,5 °C. Allerdings nahm die Parasitämie in der folgenden Woche deutlich zu und erreichte am 20. Tag 21 %, begleitet von offensichtlicher Hyperthermie. Im Gegensatz dazu zeigte ein Hund, der mit kontinuierlich in vitro kultiviertem B. gibsoni (Wuhan-Isolat) infiziert war, kein hohes Maß an Parasitämie. Der Höhepunkt der Parasitämie betrug jedoch nicht mehr als 2 %. Die Körpertemperatur blieb normal und stieg während des Experiments nicht über 40 °C.

Veränderungen der Parasitämie und der Temperatur nach Infektion mit 2 × 108 infizierten Erythrozyten von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) in vivo- und in vitro-Kulturen. A Veränderungen in der Parasitämie von zwei Hunden, die mit B. gibsoni (Wuhan-Isolat) aus In-vivo- (rot) bzw. In-vitro-Kulturen (blau) infiziert waren. B Veränderungen der Temperatur von zwei Hunden, die mit B. gibsoni (Wuhan-Isolat) aus In-vivo- (rot) bzw. In-vitro-Kulturen (blau) infiziert waren

Während der In-vitro-Anpassung beeinflussen Umweltschwankungen die Entwicklung des Parasiten-Blutstadiums erheblich, beispielsweise morphologische Veränderungen oder die Infektiosität natürlicher Wirte. Um DEGs basierend auf diesen Variationen weiter zu identifizieren, haben wir RNA-Seq-Daten zu B. gibsoni im Blutstadium (Wuhan-Isolat) aus In-vivo- und In-vitro-Kulturen generiert.

Qualifizierte cDNA-Bibliotheken wurden aus in vivo und in vitro kultivierten Parasiten von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) mit drei biologischen Replikaten hergestellt. Die Rohdaten lagen nach der Illumina-Sequenzierung zwischen 24,47 und 30,36 GB und wurden in der NCBI Sequence Read Archive (SRA)-Datenbank abgelegt. Nach dem Entfernen unqualifizierter und minderwertiger Lesevorgänge wurden saubere Lesevorgänge mit einem Bereich von 23,55 bis 29,16 GB erhalten und für die folgende Analyse verwendet. Unter Verwendung der Trinity-Software und der Genomführung von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) wurden 9561 Transkripte und 1340 Unigene für die anschließende Analyse von DEGs zusammengestellt.

DEGs wurden gescreent, um Unterschiede zwischen der Versuchs- und der Kontrollgruppe zu identifizieren. Basierend auf einer Reihe von Kriterien mit P-adjustiertem Wert < 0,05 und |log2FoldChange|> 1 wurden beim Vergleich von In-vitro- und In-vivo-Gruppen 711 Unigene als signifikante DEGs identifiziert. Insgesamt wurden 377 Unigene hochreguliert und 334 Unigene herunterreguliert (Abb. 3A). Um die Funktion der signifikanten DEGs besser zu verstehen, wurden offene Leserahmen (ORF) mithilfe der TransDecoder-Software vorhergesagt und dem eggNOG-Mapper-Onlinedienst zur weiteren GO-Analyse und KEGG-Signalweganreicherung unterzogen (Abb. 3B, C) (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Für die funktionelle Annotation von GO wurden Unigene in drei GO-Hauptkategorien eingeteilt: biologische Prozesse, molekulare Funktionen und zelluläre Komponenten. Die meisten Unigene wurden zellulären und metabolischen Prozessen innerhalb der Kategorie biologischer Prozesse zugeordnet. Mehr als 150 Unigene wurden katalytische Aktivität und Bindungsbegriffe für molekulare Funktionen zugeordnet. In der letzten Kategorie, zellulären Komponenten, wiesen Begriffe mit der Bezeichnung Zelle und Zellteile einen größeren Anteil an Unigenen auf als alle anderen Begriffe. Zur Anreicherung des KEGG-Signalwegs wurden alle Unigene sechs Hauptkategorien zugeordnet: Stoffwechsel, genetische Informationsverarbeitung, menschliche Krankheiten, Umweltinformationsverarbeitung, zelluläre Prozesse und Organismussysteme. Unter diesen waren Stoffwechsel, Translation, Signaltransduktion, Zellwachstum und Umweltanpassungswege die wichtigsten Anreicherungsfaktoren, die möglicherweise mit der Entwicklung des Parasiten im asexuellen Stadium während der In-vitro-Anpassung zusammenhängen.

GO-Term-Annotation und KEGG-Signalweganreicherung signifikanter DEGs zwischen In-vitro- und In-vivo-Gruppen. Ein Vulkandiagramm der relativen mRNA-Expression von B. gibsoni (Wuhan-Isolat), kontinuierlich in vitro kultivierten Parasiten im Vergleich zu in vivo ursprünglichen Parasiten. Die Gene links (blau) und rechts (gelb) sind herunterregulierte bzw. hochregulierte DEGs. B GO-Termanmerkung wichtiger DEGs. C-KEGG-Signalweganreicherung von gescreenten signifikanten DEGs

Um die Genauigkeit der RNA-Seq-Daten zu überprüfen, wurde qRT-PCR mit 10 zufällig ausgewählten Unigenen durchgeführt (Abb. 4). Die Ergebnisse der qRT-PCR zeigten ähnliche Expressionsmuster wie die RNA-Seq-Daten, obwohl es aufgrund von Unterschieden zwischen den Methoden Unterschiede in der log2-fachen Änderung zwischen RNA-Seq- und qRT-PCR-Daten gab. Die spezifischen Primersequenzen sind in der Zusatzdatei 2: Tabelle S2 aufgeführt.

RNA-Seq-Datenvalidierung von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) in vivo und in vitro kultivierten Gruppen. qRT-PCR-Validierung des Expressionsniveaus zufällig ausgewählter DEGs. Die Expressionsniveaus wurden auf GAPDH normalisiert und relativ zu den Kontrollen dargestellt

Es wurden erhebliche Veränderungen im Transkriptniveau von Genen festgestellt, die an der Parasiteninvasion roter Blutkörperchen, der Parasitenvirulenz sowie der Entwicklung im asexuellen und sexuellen Stadium beteiligt sind (Tabelle 1). Wir fanden zwei essentielle Gene, die für das Merozoiten-Oberflächenprotein 2 und das Mikronem-Protein 14 kodieren und in In-vitro-Kulturgruppen von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) höhere Transkriptmengen aufwiesen. Diese beiden Gene sind möglicherweise am Invasionsprozess der roten Blutkörperchen des Wirts beteiligt, was mit den beobachtbaren Phänomenen einer schnellen asexuellen Proliferation und einer hohen Parasitämie übereinstimmt. Darüber hinaus ergab die Datenanalyse, dass die Transkriptmengen eines Gens, das für das Kugelkörperprotein 3 kodiert, während der In-vitro-Kultivierung deutlich anstiegen. Frühere Studien zeigten, dass die verkürzte Kopie 11 (sbp2t11) des sphärischen Körperproteins 2 von B. bovis aufgrund ihres konsistenten Hochregulierungsmusters in vier geografisch unterschiedlichen abgeschwächten Stämmen im Vergleich zu ihren virulenten Elternstämmen als spezifischer Abschwächungsmarker identifiziert wurde (33). Das sphärische Körperprotein 3 von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) wies jedoch eine geringe Identität mit der verkürzten Kopie 11 des sphärischen Körperproteins 2 von B. bovis auf. Daher ist es erforderlich, ob SBP3 von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) mit dem Verlust oder der Zunahme der Virulenz zusammenhängt gründlich untersucht werden. Von den DEGs in den RNA-Seq-Daten wurden zwei Gene, die für Hook-assoziiertes Protein 2 (hap2) und den AP2-Transkriptionsfaktor (AP2-G) kodieren, nach kontinuierlicher In-vitro-Kultivierung herunterreguliert. In P. falciparum wurden zuvor zwei an der Gametozytogenese beteiligte ApiAP2-Transkriptionsfaktor-Gene (PF3D7_1222600 und PF3D7_1222400) in konvergenten Nonsense-Mutanten nach einer langfristigen Labor-In-vitro-Anpassung identifiziert, was zu mehr asexuellen Stadien des Parasiten-In-vitro-Wachstums führte [18]. In ähnlicher Weise kann die verminderte Expression von Genen im Zusammenhang mit dem Sexualstadium, einschließlich Hook-assoziiertem Protein 2 (hap2) und AP2-Transkriptionsfaktor (AP2-G), nach kontinuierlicher In-vitro-Anpassung zum Überleben und Wachstum im asexuellen Stadium beitragen. Umgekehrt bieten Wirbeltierwirte Gametozyten eine natürlichere Umgebung, die die Übertragung durch Zecken begünstigt; Daher hätten diese Gene im Sexualstadium unter diesen Bedingungen ein höheres Expressionsniveau.

ApiAP2-Transkriptionsfaktoren wurden funktionell in Malaria- und Toxoplasma-Parasiten identifiziert. Diese Transkriptionsfaktorfamilie kann über sequenzspezifische Motive im Promotor an genomische DNA binden und jedes Entwicklungsstadium von Apicomplexan-Parasiten regulieren. In unserer RNA-Seq-Datenanalyse wurden mehrere AP2-Transkriptionsfaktor-Gene nach kontinuierlicher In-vitro-Anpassung hoch- oder herunterreguliert, was signifikante Transkriptomveränderungen in der gesamten AP2-Genfamilie während der Entwicklung im Blutstadium von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) zeigte. Wir präsentieren ein systematisches Screening der AP2-Genfamilie im Genom von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) (unveröffentlichte Daten). Einige AP2-Gene wurden signifikant unterschiedlich exprimiert, während andere mithilfe von tBLASTn mit homologen Arten wie B. bovis oder B. microti erhalten wurden. Somit waren in B. gibsoni (Wuhan-Isolat) 20 Gene vorhanden, die AP2-Domänen enthaltende Proteine ​​codieren (Abb. 5).

Schematische Darstellung der Lage und Anzahl der AP2- und ACDC-Domänen in der AP2-Transkriptionsfaktorfamilie von B. gibsoni (Wuhan-Isolat). AP2- und ACDC-Domänen werden in Schwarz bzw. Blau angezeigt. Die Gen-ID und Proteinlänge jedes AP2-Transkriptionsfaktors von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) sind ebenfalls angegeben

Die AA-Sequenzen der AP2-Proteine ​​von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) wurden mit dem ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder) vorhergesagt. Die vorhergesagten Proteinlängen waren sehr unterschiedlich und reichten von 184 bis 924 aa. Darüber hinaus wurden konservierte funktionelle Domänen mit dem SMART-Tool bioinformatisch vorhergesagt und zeigten verschiedene AP2-Domänen, die über AP2-Transkriptionsfaktoren verteilt waren. Die meisten dieser vorhergesagten AP2-Proteine ​​enthielten eine einzelne AP2-Domäne, wohingegen drei Mitglieder mit mehr als einer AP2-Domäne identifiziert wurden, beispielsweise zwei oder drei. Wir schlagen vor, dass verschiedene AP2-Domänen desselben Proteins an unterschiedliche DNA-Motive binden und nacheinander die Expression verschiedener Zielgene regulieren. Ein ähnlicher Regulationsmechanismus wurde zuvor bei P. falciparum identifiziert, einschließlich PfAP2-I (PF3D7_1007700) [34]. Der AP2-Transkriptionsfaktor enthält drei AP2-Domänen, die mehrere unterschiedliche DNA-Sequenzen erkennen können; Allerdings ist nur die dritte Domäne für die Entwicklung des Blutstadiums essentiell. Es wurden zwei AP2-Proteine ​​mit einer ACDC-Domäne (einer AP2-koinzidenten Domäne, meist am C-Terminus) nachgewiesen. Diese konservierte Domäne (ungefähr 80–90 aa) befindet sich hauptsächlich am C-Terminus des AP2-Transkriptionsfaktors und befindet sich in anderen AP2-Proteinen des Apicomplexan-Parasiten, einschließlich B. bovis, P. falciparum und T. gondii (35). Die Beteiligung dieses nicht charakterisierten Bereichs an der Kernbiologie bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus wurden weder Transmembranregionen noch Signalpeptide in AP2-Proteinen von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) identifiziert.

Da diese Transkriptionsfaktorfamilie als Schlüsselregulator der Parasitenentwicklung fungiert, führten wir eine qRT-PCR durch, um die Veränderungen des Transkriptionsniveaus in der gesamten AP2-Genfamilie zu analysieren (Abb. 6). Die für diesen Test verwendeten Primersequenzen sind in der Zusatzdatei 3: Tabelle S3 aufgeführt. Zwei AP2-Gene (BgWH_04g01044 und BgWH_04g00976) wurden deutlich herunterreguliert. Es wurde vorgeschlagen, dass diese beiden AP2-Proteine ​​die Entwicklung des Parasiten im sexuellen Stadium regulieren könnten, ähnlich wie AP2-G [36]. Anschließend konzentrierten wir uns auf mehrere hochregulierte AP2-Gene, darunter BgWH_03g00908 (unbekannte Funktion), BgWH_04g00415 (unbekannte Funktion), BgWH_03g00279 (Homolog von PfSIP2), BgWH_04g00636 (unbekannte Funktion), BgWH_01g00121 (Homolog von PfAP2-O) und BgWH_ 02g00573 (unbekannte Funktion ). In P. falciparum wurde PfSIP2 zuvor als Heterochromatin-assoziierter Transkriptionsfaktor beschrieben, der ausschließlich an subtelomere Regionen bindet und die Transkription der nachgeschalteten var-Genfamilie zum Schweigen bringt (37). Ebenso wurde kürzlich gezeigt, dass PfAP2-O das Transkriptionsgedächtnis von Var-Genen in asexuellen Stadien beeinflusst und zu funktionellen, in den Mitteldarm eindringenden Ookineten im Mückenstadium beiträgt [38,39,40]. Es wurde auch gezeigt, dass das Homolog von PfAP2-O in Toxoplasma gondii namens TgAP2XI-5 die Transkription entscheidender Virulenzfaktor-Gene steuert [41]. Daher könnten BgWH_03g00279 und BgWH_01g00121 eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Expression von Genen spielen, die mit Virulenz oder Parasitenvermehrung zusammenhängen. Interessanterweise wurde festgestellt, dass ein AP2-Gen (BgWH_03g00908) nach In-vitro-Kultivierung dreifach hochregulierte Transkriptionsniveaus aufwies; Homologe von BgWH_03g00908 in anderen apikomplexen Parasiten wie P. falciparum (PF3D7_1239200) und B. bovis (BBOV_IV011830) sind jedoch weitgehend unbekannt. Seine deutlich erhöhte Expression nach In-vitro-Anpassung dürfte mögliche Rollen bei der Regulierung der Parasiten-Merogonie im asexuellen Entwicklungsstadium veranschaulichen. Daher wurde dieser AP2-Transkriptionsfaktor für die weitere Untersuchung ausgewählt und als BgAP2-M bezeichnet.

Relatives Transkriptionsniveau der Gene der AP2-Familie von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) zwischen in vivo (rot) und in vitro kultivierten (blau) Parasiten im Blutstadium durch qRT-PCR-Assays. Die statistische Analyse: ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns: nicht signifikant (ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test). Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD für drei biologische Replikate dar

Wir haben dieses Gen zunächst aus gDNA und cDNA von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) geklont. Das BgAP2-M-Gen enthielt einen 1989 bp großen ORF ohne Introns, der für ein vorhergesagtes Protein von 73 kDa kodierte.

Das BgAP2-M-Protein voller Länge wurde mit mutmaßlichen Orthologen anderer Apicomplexan-Arten abgeglichen, darunter B. bigemina, B. ovata, B. divergens, B. bovis, B. microti, T. annulata, P. falciparum und P. berghei, um die phylogenetische Analyse durchzuführen (Abb. 7). BgAP2-M wurde in einer Gruppe mit Bdiv_024900c, BOVATA_016290 und BBBOND_0110120 gruppiert, was eine enge Verwandtschaft erkennen lässt. BBOV_IV011830 schien eine relativ geringere Identität mit BgAP2-M aufzuweisen als mit den Orthologen von B. bigemina, B. ovata und B. divergens. Ähnliche Fälle wurden für andere Mitglieder der AP2-Transkriptionsfaktorfamilie in B. gibsoni (Wuhan-Isolat) berichtet. Es überrascht nicht, dass PF3D7_1239200 und PBANKA_1453700 miteinander verbunden waren und entfernt mit BgAP2-M verwandt waren, wahrscheinlich aufgrund ihrer unterschiedlichen taxonomischen Reihenfolge. Darüber hinaus werden schematische Diagramme von BgAP2-M und den zugehörigen Proteinen vorgestellt. BgAP2-M und seine Orthologen in B. bigemina, B. ovata, B. divergens, B. bovis und T. annulata besitzen eine einzelne AP2-Domäne und eine ACDC-Domäne. Im Gegensatz dazu wiesen BMR1_03g01605, PF3D7_1239200 und PBANKA_1453700 zwei AP2-Domänen auf, die an verschiedenen Proteinpositionen verteilt waren, was auf die Bindung unterschiedlicher DNA-Sequenzen hinweist. Als in die nukleare Umgebung importierte funktionelle Transkriptionsfaktoren wurden klassische NLS mithilfe der Online-Tools von NLStradamus vorhergesagt. Die Vorhersage identifizierte eine NLS-Länge von 20 Aminosäuren in BgAP2-M und verwandten Proteinen anderer Apicomplexan-Parasiten, was auf einen möglichen NLS-vermittelten Kernimport schließen lässt.

Phylogenetische Analyse und schematische Diagramme von BgAP2-M unter Apicomplexan-Parasiten. Das linke Feld zeigt die phylogenetische Beziehung der BgAP2-M-Proteinsequenzen, die AP2-konservierte Domänen enthalten, mit Homologen anderer Apicomplexan-Parasiten unter Verwendung der Neighbor-Joining-Methode. Der Baum ist maßstabsgetreu gezeichnet, wobei die Zweiglängen in der Anzahl der Ersetzungen pro Standort gemessen werden. Die Zugangsnummern verwandter Proteine ​​werden markiert und aus den Online-Datenbanken PiroplasmaDB und PlasmoDB abgerufen. Das rechte Feld zeigt schematische Diagramme von BgAP2-M und verwandten Proteinen in anderen Apicomplexan-Parasiten. Konservierte Domänen, einschließlich AP2-Domänen (orange) und ACDC-Domänen (blau), werden durch verschiedene Rechtecke sowie durch Kernlokalisierungssignale (NLS) hervorgehoben.

Darüber hinaus war die AP2-Domäne von BgAP2-M unter anderen Apicomplexan-Parasiten gut konserviert, wie in Abb. 8A gezeigt. Außergewöhnliche Sequenzähnlichkeiten deuteten auf das Vorhandensein identischer DNA-Motive im Genom hin. Es wurde zuvor festgestellt, dass TA13515 (Ortholog von PF3D7_1222600 PfAP2-G) an identische GxGTACxC-Motive bindet [42]. Die sehr ähnliche Region hat eine klassische Sekundärstruktur, drei Stränge und eine Helix, was auf eine analoge Art der DNA-Bindung hinweist. Durch die Homologiemodellierung der Tertiärstruktur unter Verwendung von PF3D7_1466400 als Vorlage [43] wurden die kanonischen Strukturen mit drei Strängen und einer Helix vorhergesagt, wie in Abb. 8B dargestellt.

Mehrere Alignments und Tertiärstrukturvorhersage der AP2-konservierten Domäne in BgAP2-M. A-AP2-Domänen von BgAP2-M und ähnlichen Orthologen anderer Apicomplexan-Parasiten wurden mit den auf der linken Seite des Diagramms markierten Zugangsnummern verglichen. Die vorhergesagten Sekundärstrukturen wurden mit Pfeilen in verschiedenen Farben, β-Strängen (gelb) und α-Helix (blau), hervorgehoben. B Die Tertiärstrukturvorhersage der BgAP2-M AP2-Domäne. Linkes Feld: vorhergesagte Tertiärstruktur der AP2-Domäne von BgAP2-M (erzeugt mit SWISS-MODEL). Rechtes Feld: die veröffentlichte Tertiärstruktur der AP2-Domäne von PF3D7_1466400. Dargestellt sind die β-Stränge (gelb) und die α-Helix (blau).

Vorbereitete polyklonale Antikörper gegen BgAP2-M-Peptide wurden verwendet, um die Expression des nativen BgAP2-M-Proteins in B. gibsoni (Wuhan-Isolat) zu identifizieren. Im Lysat von in vitro kultiviertem oder in vivo kultiviertem B. gibsoni (Wuhan-Isolat) wurde eine spezifische Bande von etwa 73 kDa nachgewiesen, was mit dem vorhergesagten Molekulargewicht des reifen Proteins übereinstimmt (Abb. 9). Im Gegensatz dazu wurden in der Negativkontrollgruppe keine Produkte nachgewiesen. Der Nachweis des Histon-H3-Proteins zeigte eine gleichmäßige Proteinbeladung auf verschiedenen Spuren.

Immunoblotting von nativem BgAP2-M-Protein aus in vitro kultiviertem oder in vivo B. gibsoni (Wuhan-Isolat). Spur M: Molekulargewichtsmarker; Spur 1: Lysat von in vitro kultiviertem B. gibsoni, sondiert mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen BgAP2-M-Peptide; Spur 2: Lysat von in vivo B. gibsoni, sondiert mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen BgAP2-M-Peptide; Spur 3: Lysat nicht infizierter Canis-Erythrozyten, sondiert mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen BgAP2-M-Peptide; Spur 4: Lysat von in vitro kultiviertem B. gibsoni, sondiert mit präimmunem Kaninchenserum; Spur 5: Lysat von in vivo B. gibsoni, sondiert mit präimmunem Kaninchenserum; Spur 6: Lysat nicht infizierter Canis-Erythrozyten, sondiert mit präimmunem Kaninchenserum. Pfeile zeigen die entsprechenden Bänder an. Als Ladungskontrolle wurde der Anti-Histon-H3-Antikörper zum Nachweis der Expression von BgAP2-M verwendet

Die Lokalisierung von BgAP2-M wurde durch eine IFA unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen BgAP2-M-Peptide bestimmt. Der IFA zeigte eine starke Reaktivität mit dem Antiserum sowohl bei den intra- als auch bei den extraerythrozytären Parasiten von B. gibsoni (Abb. 10). Wie erwartet war BgAP2-M in den Kernen von B. gibsoni lokalisiert. In der Negativkontrollgruppe wurde jedoch kein Fluoreszenzsignal beobachtet. Das Zytosol von B. gibsoni wurde mit Antikörpern gegen GAPDH gefärbt.

Indirekte Immunfluoreszenztests zum Nachweis der Position des nativen BgAP2-M-Proteins in B. gibsoni (Wuhan-Isolat). Das BgAP2-M-Protein und die Parasitenkerne wurden mit polyklonalen Antikörpern gegen BgAP2-M-Peptide (rot) bzw. Hoechst 33.342 (blau) gefärbt. Anti-GAPDH-Antikörper wurden verwendet, um das Zytosol von Parasiten (grün) anzufärben. a Extrazelluläre Merozoiten. b Ringstufe. c Dyadenbühne. d Tetradenstadium. e Negativkontrolle: Der primäre Antikörper war präimmunes Kaninchenserum. Maßstabsbalken = 5 μm

In dieser Studie wurden, basierend auf der erfolgreichen Etablierung eines In-vitro-Kultursystems von B. gibsoni (Wuhan-Isolat), die Veränderungen in der Morphologie und Infektiosität von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) nach langfristiger In-vitro-Kultivierung beobachtet und identifiziert. Die Transkriptomsequenzierung wurde unter Verwendung von in vivo und in vitro kultivierten B. gibsoni (Wuhan-Isolat) im Blutstadium durchgeführt. Einige DEGs, die mit dem Wachstum, der Invasion und der Virulenz von Parasiten in Zusammenhang stehen, wurden identifiziert, und es wurde eine Familie der ApiAP2-Transkriptionsfaktoren identifiziert, darunter ein neuartiger AP2-Transkriptionsfaktor (BgAP2-M), der möglicherweise an der Merogonie von Parasiten im asexuellen Stadium beteiligt ist . Das native BgAP2-M-Protein hatte ein Molekulargewicht von etwa 73 kDa, was mit der vorhergesagten Größe übereinstimmt. Darüber hinaus war das BgAP2-M-Protein im Kern von B. gibsoni lokalisiert, einschließlich der intra- und extraerythrozytären Stadien, was ein gemeinsames Phänomen mit anderen in Plasmodium spp. identifizierten AP2-Transkriptionsfaktoren aufwies. und Toxoplasma spp.

Es wurden In-vitro-Kultursysteme mehrerer Babesia-Arten etabliert, darunter unter anderem B. bovis, B. bigemina, B. gibsoni, B. duncani und B. orientalis [11,12,13, 44, 45], die a praktische Plattform für genetische Manipulation und Erforschung der Interaktion zwischen Parasiten und Wirten. Während der kontinuierlichen In-vitro-Kultivierung scheinen sich die Morphologie und Infektiosität der Parasiten jedoch erheblich zu verändern, möglicherweise aufgrund von Unterschieden im Nährstoffgehalt oder physikalischen Umweltfaktoren [21]. Beispielsweise wurde in einer früheren Studie das B. gibsoni Oita-Isolat in der 214. Subkultur 738 Tage lang erfolgreich in vitro kultiviert; Allerdings nahm die Größe der Parasiten zu und es wurden mehrere Formen von Parasiten beobachtet, wie zum Beispiel große ovale oder blütenblattförmige Parasiten. Gleichzeitig waren die Infektiosität und Virulenz von Parasiten in natürlichen Wirten stark verringert [13, 16]. In ähnlicher Weise erfuhr B. gibsoni (Wuhan-Isolat) größere morphologische Veränderungen von kleinen ringförmigen Parasiten zu großen ringförmigen Parasiten, dyadenförmigen Parasiten, tetradenförmigen Parasiten, oktoploiden Parasiten und Schizonten. Darüber hinaus wurde eine geringere Infektiosität bei Hunden beobachtet.

Um die Transkriptionsvariation in Genen basierend auf diesen Veränderungen in der Morphologie und Infektiosität von Parasiten nach In-vitro-Anpassung weiter zu untersuchen, wurde eine Transkriptomsequenzierung an B. gibsoni (Wuhan-Isolat) im Blutstadium aus In-vivo- und In-vitro-Kulturgruppen durchgeführt. Bemerkenswerterweise zeigten einige am Parasiteninvasionsprozess beteiligte Gene nach In-vitro-Anpassung eine erhöhte Expression, wie z. B. das Merozoiten-Oberflächenprotein 2 und das Mikronem-Protein 14; Dies resultierte vermutlich aus einer erhöhten asexuellen Vermehrung und einer hohen Parasitämie in der In-vitro-Umgebung, die frei vom Druck des Immunsystems des Wirts war. In ähnlicher Weise wurde auch bei P. falciparum gezeigt, dass Claudin-like Apicomplexan Microneme Protein (CLAMP) als Invasionsfaktor in den langfristig in vitro adaptierten Stämmen ein höheres Transkriptniveau aufweist als in den klinischen In vivo-Isolaten [19]. Darüber hinaus war auch das Transkriptniveau des sphärischen Körperproteins 3 in B. gibsoni (Wuhan-Isolat) deutlich erhöht. Frühe Studien zu B. bovis ergaben, dass die verkürzte Kopie 11 des sphärischen Körperproteins 2 (sbp2t11) eine wichtige Rolle als Abschwächungsmarker spielt, wenn vier verschiedene abgeschwächte Stämme mit ihren entsprechenden virulenten Stämmen verglichen werden [33].

Dennoch hatte SBP3 von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) eine geringe Ähnlichkeit mit sbp2t11 von B. bovis, obwohl beide zur Familie der Kugelkörperproteine ​​gehören. Ob die Hochregulierung des SBP3-Gens die geringere Virulenz von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) darstellt, bedarf daher einer weiteren experimentellen Bestätigung. Für Plasmodium spp. und Babesia spp. haben in-vitro-adaptierte Laborstämme normalerweise keinen Zugang zu Übertragungsvektoren (Mücken oder Zecken); Daher erleben sie sowohl ein asexuelleres Erythrozytenstadium als auch ein weniger sexuelles Stadium. Folglich waren die Gene, die für Antigene im Sexualstadium kodieren, in den in vitro kultivierten Parasiten im Vergleich zu den in vivo-Isolaten herunterreguliert. Beispielsweise sind Gene im Zusammenhang mit dem Sexualstadium (Gametenantigen 27/25) und das AP2-Transkriptionsfaktor-Gen (AP2-G), die sowohl in den laboradaptierten Stämmen P. falciparum als auch P. knowlesi unbedingt herunterreguliert werden müssen unerlässlich für das Engagement und die Entwicklung im sexuellen Stadium [17]. Bei B. gibsoni (Wuhan-Isolat) war es keine Ausnahme, dass ähnliche Proteine ​​im sexuellen Stadium (Hap2 und AP2-G) herunterreguliert wurden, um die Gametozytogenese zu verhindern.

Interessanterweise wurden mehrere AP2-Transkriptionsfaktoren hoch- oder herunterreguliert, und ein ähnliches Phänomen wurde bei anderen Plasmodium-Arten beobachtet. Im Jahr 2005 wurde erstmals beschrieben, dass die Transkriptionsfaktorfamilie ApiAP2 (Apicomplexan AP2) konservierte Domänen enthält, die der DNA-Bindungsdomäne des Apetala2/Ethylen-Response-Faktors (AP2/ERF) in Pflanzen ähneln (22, 46), und ist bisher gut identifiziert in Plasmodium spp. oder Toxoplasma spp. Frühere Studien zur Kulturanpassung von P. falciparum im Labor haben Transkriptionsveränderungen in mehreren AP2-Transkriptionsfaktor-Genen, einschließlich ApiAP2-Genen (PF3D7_1222600, PF3D7_1222400 und PF3D7_1342900), ergeben, bei denen sich herausstellte, dass sie Funktionsverlustmutationen mit vorzeitigen Stoppcodons aufweisen [ 18]. Diese adaptiven Nonsens-Mutationen könnten wahrscheinlich proportional mehr asexuelle Stadien für das Überleben und die Vermehrung hervorbringen, zusammen mit einer zunehmenden Widerstandsfähigkeit gegenüber häufigen Temperaturschwankungen während der In-vitro-Kultivierung. Mithilfe von qRT-PCR-Assays konnten wir Transkriptionsveränderungen bei allen AP2-Transkriptionsfaktor-Mitgliedern von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) nachweisen. Bemerkenswerterweise wurden zwei AP2-Transkriptionsfaktor-Gene (BgWH_04g01044, Homolog von BBOV_III009600 und BgWH_04g00976, Homolog von BBOV_III008870) während der In-vitro-Anpassung herunterreguliert. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese beiden Transkriptionsfaktoren die Entwicklung im sexuellen Stadium regulieren könnten. Daher sind Genstörungs- und Chromatin-Immunpräzipitations-(ChIP)-seq-Assays in zukünftigen Studien dringend erforderlich. Auffälliger war die deutliche Hochregulierung von fünf AP2-Transkriptionsfaktor-Genen, von denen zwei Homologe von PfAP2-O und PfSIP2 sind. Genomweite ChIP-Assays beschrieben eine hochaffine Bindung mit Promotoren subtelomerer Virulenzgenfamilien für PfAP2-O und PfSIP2, die das Wachstum des Parasiten im asexuellen Stadium signifikant beeinflusst [37, 39]. Die Hochregulierung von PfAP2-O- und PfSIP2-Homologen in B. gibsoni (Wuhan-Isolat) war wahrscheinlich mit erhöhten Zyklen im asexuellen Stadium und einer durch Kulturanpassung verursachten Vermehrung verbunden. Interessanterweise wurde ein AP2-Transkriptionsfaktor von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) (ein Homolog von PF3D7_1239200 oder BBOV_IV011830) nach der In-vitro-Kultivierung hochreguliert, was auf seine bedeutende Rolle bei der Regulierung der Transkription von Genen im Zusammenhang mit Merogonie im asexuellen Stadium hinweist. Wir haben einen neuen AP2-Transkriptionsfaktor identifiziert, BgAP2-M. Durch mehrere Alignments wurde festgestellt, dass BgAP2-M nur eine AP2-Domäne besitzt, was eine hohe Ähnlichkeit der AA-Sequenz mit anderen Apicomplexan-Arten zeigte.

Darüber hinaus wurde eine kanonische Sekundärstruktur aus drei Strängen und einer Helix vorhergesagt, was auf eine stabilere Rekrutierung stromaufwärts der Zielgene schließen lässt. Darüber hinaus wurde eine neuartige ACDC (AP2-koinzidente Domäne, hauptsächlich am C-Terminus (ACDC)) entdeckt, die bei apikomplexen Parasiten gut konserviert ist. Bemerkenswerterweise befindet sich diese unbekannte Domäne ausschließlich am C-Terminus von AP2-Transkriptionsfaktoren. Daher Das gleichzeitige Vorkommen dieser beiden Domänen könnte eine mögliche Rolle bei der Gentranskription, Chromatinmodifikation und Remodellierung implizieren [35]. Um das native BgAP2-M-Protein weiter zu charakterisieren, wurden polyklonale Antikörper gegen BgAP2-M-Peptide hergestellt. Die Größe der nativen BgAP2-M hatte im Lysat von in vitro kultivierten oder in vivo kultivierten B. gibsoni (Wuhan-Isolat) eine Größe von ~ 73 kDa, wie durch Western Blot bestimmt wurde, was mit der theoretischen Vorhersage übereinstimmte. IFA enthüllte die Lokalisierung der Kerne von B. gibsoni Intensive Fluoreszenzsignale wurden entweder bei extrazellulär austretenden Merozoiten oder intrazellulären Parasiten im Ring-, Dyaden- und Tetradenstadium beobachtet, was auf eine mögliche Rolle von BgAP2-M bei der Merogonienentwicklung schließen lässt. Zukünftige Studien sollten sich auf funktionelle Experimente konzentrieren, wie z Konstruktion von Gen-Disruptionsmutanten oder Durchführung von ChIP-seq-Assays. Die Homologen von BgAP2-M in anderen Plasmodium-Arten (P. falciparum, P. berghei und P. yoelii) konnten jedoch nach mehreren Versuchen nicht direkt im Blutstadium zerstört werden, was auf seine äußerst wichtige Rolle bei der Parasitenentwicklung hinweist [47]. ,48,49].

Die Transkriptomsequenzierung wurde zum ersten Mal an B. gibsoni (Wuhan-Isolat) in vivo- und in vitro-Kulturen basierend auf Veränderungen in der Morphologie und Infektiosität durchgeführt. Auf dieser Grundlage wurde eine Reihe von DEGs entdeckt, die ein genaueres Verständnis der Wege im Zusammenhang mit der Parasiteninvasion, der Virulenz sowie dem Wachstum im asexuellen und sexuellen Stadium ermöglichen. Eine weitere qRT-PCR-Analyse der AP2-Transkriptionsfaktorfamilie von B. gibsoni (Wuhan-Isolat) identifizierte einen neuen AP2-Transkriptionsfaktor (BgAP2-M) mit einer Größe von ~ 73 kDa. Es lokalisierte sich in den Kernen von B. gibsoni aus extrazellulären und intrazellulären Stadien. Die vorliegende Studie erklärt ausführlich die Transkriptionsänderungen in B. gibsoni (Wuhan-Isolat) nach kontinuierlicher In-vitro-Kultivierung. Darin wird über einen neuartigen AP2-Transkriptionsfaktor (BgAP2-M) berichtet, der möglicherweise die Merogonie von Parasiten während der asexuellen Entwicklungsphase reguliert. Die spezifischen Zielgene, die im asexuellen Stadium durch BgAP2-M reguliert werden, sind jedoch weiterhin unbekannt und weitere Forschung ist erforderlich.

Alle in dieser Studie verwendeten RNA-Seq-Daten wurden in der NCBI SRA-Datenbank hinterlegt (Zugangsnummern: SRR24288283, SRR24288284, SRR24288285, SRR24288286, SRR24288287 und SRR24288288).

Genomische DNA

Komplementäre DNA

Quantitative Echtzeit-PCR

Rekursives Strukturgleichungsmodell

Grundlegendes Suchtool für lokale Ausrichtung

Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Meerrettich-Peroxidase

Kernlokalisierungssignal

Rinderserumalbumin

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Unzutreffend.

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32273030 und 31772729) und Fundamental Research Funds for the Central Universities in China (Projekt 2662020DKPY016) unterstützt.

Staatliches Schlüssellabor für landwirtschaftliche Mikrobiologie, Hochschule für Veterinärmedizin, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070, Hubei, China

Zhen Han, Yaxin Zheng, Yu Shi, Fangwei Chen, Chenglong Wu, Lingna Wang, Shiyu Lu, Dongfang Li, Xingai Guan, Lan He und Junlong Zhao

Schlüssellabor für präventive Veterinärmedizin in der Provinz Hubei, Kooperatives Innovationszentrum für nachhaltige Schweineproduktion, Wuhan, 430070, Hubei, China

Zhen Han, Yaxin Zheng, Yu Shi, Fangwei Chen, Chenglong Wu, Lingna Wang, Shiyu Lu, Dongfang Li, Xingai Guan, Lan He und Junlong Zhao

Schlüssellabor für die Entwicklung veterinärmedizinischer Diagnoseprodukte, Landwirtschaftsministerium der Volksrepublik China, Wuhan, 430070, Hubei, China

Lan He & Junlong Zhao

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ZH, LH und JZ haben die Studie entworfen und das Manuskript verfasst. ZH, YZ, ZN und HZ führten die Experimente durch. YZ und XS beteiligten sich an der Datenanalyse. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Junlong Zhao.

Die Unterbringung und Behandlung der Versuchstiere erfolgte gemäß den festgelegten Regeln für die Verwaltung der Angelegenheiten von Versuchstieren in der Volksrepublik China. Alle Experimente wurden mit Genehmigung des Labortierforschungszentrums der Provinz Hubei und der Ethikkommission der Huazhong Agricultural University (Genehmigungsnummer: HZAUMO-2019-016) durchgeführt.

Unzutreffend.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

GO-Begriffe und KEGG-Pathway-Anmerkungen von DEGs in dieser Studie.

qRT-PCR-Primer zur Validierung von RNA-Sequenzierungsdaten.

qRT-PCR-Primer für die Gene der ApiAP2-Familie von B. gibsoni.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Han, Z., Zheng, Y., Shi, Y. et al. Transkriptionsvariation bei Babesia gibsoni (Wuhan-Isolat) zwischen In-vivo- und In-vitro-Kulturen im Blutstadium. Parasites Vectors 16, 268 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05869-z

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Eingegangen: 09. Mai 2023

Angenommen: 04. Juli 2023

Veröffentlicht: 07. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05869-z

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